PCR反應(yīng)設(shè)計(jì)引物需考慮問題：

1．酶切位點(diǎn)

兩個(gè)酶切位點(diǎn)應(yīng)是載體上的，所連接片斷上沒有這兩個(gè)位點(diǎn)，且距離不能太近，否則往往導(dǎo)致兩個(gè)酶都切不好。因此，兩個(gè)酶切位點(diǎn)要緊挨在一起，只能切一個(gè)，除非恰好是與上面兩個(gè)酶在一起的酶切位點(diǎn)，最好隔四個(gè)核苷酸。且不能有堿基的交叉，比如AGATCTTAAG，這樣的位點(diǎn)比較難切。

2．酶的選擇

最好使用雙酶切效率高的，但兩個(gè)酶切點(diǎn)最好不要是同尾酶（切下來的殘基不要互補(bǔ)），否則效果相當(dāng)于單酶切，最好使用具有共同buffer，且較常用的酶（如hind3，bamh1，ecor1等），這樣可以省錢。

3．Tm的計(jì)算。

Tm是由互補(bǔ)的DNA區(qū)域決定的，而不互補(bǔ)的區(qū)域?qū)NA的溶解是沒有作用的。因此，對于引物的Tm，只有和模板互補(bǔ)的區(qū)域?qū)m才有貢獻(xiàn)。計(jì)算Tm時(shí)，只計(jì)算互補(bǔ)的區(qū)域（除非你的酶切位點(diǎn)也與模板互補(bǔ)）。設(shè)計(jì)引物的時(shí)候，先不管5'端的修飾序列，把互補(bǔ)區(qū)的Tm控制在55度以上（我喜歡控制在58以上，具體根據(jù)PCR的具體情況，對于困難的PCR，需要適當(dāng)提高Tm），再加上酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基，這樣的引物通常都是可用的，即使有小的問題，也可以挽回。

Tm溫度高的引物就比較容易克服3’發(fā)卡、二聚體及3'非特異結(jié)合等問題。簡單的計(jì)算公式可以用2+4的公式。若你計(jì)算的Tm值達(dá)到了快90 ，不包括酶切位點(diǎn)。引物公司給你發(fā)的單子是包括酶切位點(diǎn)的。自己可以再估計(jì)一下。如你設(shè)計(jì)了帶酶切位點(diǎn)的引物，總長分別為29、33個(gè)堿基，去掉酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基，分別為17、21個(gè)堿基。引物公司給的單子是70多度，實(shí)際用的只有50度，用55度擴(kuò)的結(jié)果也差不多。

其它關(guān)于Tm值的計(jì)算，有用PP5.0進(jìn)行評價(jià)的，需要考慮base number、GC%、Tm、hairpin、dimer、false priming、cross dimer等參數(shù)。

4．退火溫度

退一般退火溫度為Tm-5度，退火溫度的計(jì)算可以不把加入的酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基考慮進(jìn)去， PCR幾個(gè)循環(huán)后，引物外側(cè)的序列已經(jīng)參入了擴(kuò)增片斷中，所以你可以在預(yù)變性后多加幾步，溫度比你Tm值低些（這樣可能會增加非特異性），Tm值是你包括酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基的Primer計(jì)算出來的。

5．5’端保護(hù)堿基

一般在5'端加保護(hù)堿基,如果你擴(kuò)增后把目的條帶做膠回收轉(zhuǎn)入T-VECTOR或者其它的載體的話,酶切時(shí)可以不需加保護(hù)堿基

6．引物二聚體

關(guān)于引物二聚體，最好用primer或是其他設(shè)計(jì)引物的軟件進(jìn)行計(jì)算一下，看看引物之間的△G（自由能）的絕對值，如果小于10，一般是問題的。如果稍大，PCR時(shí)可以提高一下退火溫度，一般是沒有問題的。如果3’端形成二聚體，并且自由能絕對值較大，如果 PCR沒有條帶，建議重新設(shè)計(jì)引物。此外，所加的三個(gè)核苷酸的保護(hù)序列經(jīng)過盡心設(shè)計(jì)有時(shí)也可以降低二聚體的△G。

7．引物的設(shè)計(jì)

在設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)時(shí)，最好能盡可能多的利用引物本身的堿基。這是因?yàn)椋粋€(gè)特異性引物一般都是20bp左右，再加上酶切位點(diǎn)序列和保護(hù)性堿基，大致就是28bp左右了。而我們在設(shè)計(jì)退火溫度時(shí)，與引物的長度有關(guān)，比正常的引物(20bp) 的Tm肯定要高一些。如果我們能利用引物自身的部分序列，就可以有效地減少引物的長度。

還有，有些酶是離不開末端序列的，因此，在設(shè)計(jì)一個(gè)酶位點(diǎn)時(shí)，最好把該酶的性質(zhì)弄清楚。設(shè)計(jì)時(shí)限制性酶切位點(diǎn)是應(yīng)該在5’端的頂端。在設(shè)計(jì)引物時(shí)，常在5’端添加酶切位點(diǎn)，以利于PCR產(chǎn)物連接到載體。

設(shè)計(jì)引物時(shí)保證在最后5個(gè)核苷中含有3個(gè)A或T。先用軟件設(shè)計(jì)出合適的引物，引物的3’端是引發(fā)延伸的起點(diǎn)，因此一定要與模板準(zhǔn)確配對，應(yīng)盡量避免在引物3’端的第1位堿基是A（容易錯(cuò)配）。引物3’端最佳堿基的選擇是G和C，因?yàn)樗麄冃纬傻膲A基配對比較穩(wěn)定。目的序列上并不存在的。