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上海酶聯生物耗材有限公司
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ELISA試劑盒,人內皮抑素ELISA檢測試劑盒技術原理

時間:2013/10/23閱讀:315
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ELISA試劑盒試驗原理:
ES試劑盒是固相夾心法酶聯免疫吸附實驗(ELISA).已知ES濃度的標準品、未知濃度的樣品加入微孔酶標板內進行檢測。先將ES和*標記的抗體同時溫育。洗滌后,加入親和素標記過的HRP。再經過溫育和洗滌,去除未結合的酶結合物,然后加入底物A、B,和酶結合物同時作用。產生顏色。顏色的深淺和樣品中ES的濃度呈比例關系。

試劑盒內容及其配制
試劑盒成份(2-8℃保存)
96孔配置
48孔配置
配制

96/48人份酶標板
1塊板(96T)
半塊板(48T)
即用型

塑料膜板蓋
1塊
半塊
即用型

標準品:240pg/ml
1瓶(0.6ml)
1瓶(0.3ml)
按說明書進行稀稀

空白對照
1瓶(1.0ml)
1瓶(0.5ml)
即用型

標準品稀釋緩沖液
1瓶(5ml)
1瓶(2.5ml)
即用型

*標記的抗ES抗體
1瓶(6ml)
1瓶(3.0ml)
即用型

親和鏈酶素-HRP
1瓶(10ml)
1瓶(5.0ml)
即用型

洗滌緩沖液
1瓶(20ml)
1瓶(10ml)
按說明書進行稀釋

底物A
1瓶(6.0ml)
1瓶(3.0ml)
即用型

底物B
1瓶(6.0ml)
1瓶(3.0ml)
即用型

終止液
1瓶(6.0ml)
1瓶(3.0ml)
即用型

 

ELISA試劑盒操作注意事項
試劑應按標簽說明書儲存,使用前恢復到室溫。稀稀過后的標準品應丟棄,不可保存。
實驗中不用的板條應立即放回包裝袋中,密封保存,以免變質。
不用的其它試劑應包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質前使用。
使用一次性的吸頭以免交叉污染,吸取終止液和底物A、B液時,避免使用帶金屬部分的加樣器。
使用干凈的塑料容器配置洗滌液。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。
洗滌酶標板時應充分拍干,不要將吸水紙直接放入酶標反應孔中吸水。
底物A應揮發,避免長時間打開蓋子。底物B對光敏感,避免長時間暴露于光下。避免用手接觸,有毒。實驗完成后應立即讀取OD值。
加入試劑的順序應一致,以保證所有反應板孔溫育的時間一樣。
按照說明書中標明的時間、加液的量及順序進行溫育操作。

樣品收集、處理及保存方法
血清-----操作過程中避免任何細胞刺激。使用不含熱原和內毒素的試管。收集血液后,1000×g離心10分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。
血漿-----EDTA、檸檬酸鹽、肝素血漿可用于檢測。1000×g離心30分鐘去除顆粒。
細胞上清液---1000×g離心10分鐘去除顆粒和聚合物。
保存------如果樣品不立即使用,應將其分成小部分-70 ℃保存,避免反復冷凍。盡可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量顆粒,檢測前先離心或過濾。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍。應在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

試劑的準備
標準品:標準品的系列稀釋應在實驗時準備,不能儲存。稀釋前將標準品振蕩混勻。稀釋比例按下表中進行:
240 pg/ml
(6號標準品)
原倍濃度不用稀釋直接加入50ul。

120 pg/ml
(5號標準品)
100ul的原倍標準品加入100ul的標準品稀釋液

60 pg/ml
(4號標準品)
100ul的5號標準品加入100ul的標準品稀釋液

30 pg/ml
(3號標準品)
100ul的4號標準品加入100ul的標準品稀釋液

15 pg/ml
(2號標準品)
100ul的3號標準品加入100ul的標準品稀釋液

7.5 pg/ml
(1號標準品)
100ul的2號標準品加入100ul的標準品稀釋液

0 pg/ml
(空白對照)
原始濃度不用稀釋直接加入50ul。


洗滌緩沖液(50×)的稀釋:蒸餾水50倍稀釋。

操作步驟
使用前,將所有試劑充分混勻。不要使液體產生大量的泡沫,以免加樣時加入大量的氣泡,產生加樣上的誤差。
根據待測樣品數量加上標準品的數量決定所需的板條數。每個標準品和空白孔建議做復孔。每個樣品根據自己的數量來定,能使用復孔的盡量做復孔。
加入稀釋好后的標準品50ul于反應孔、加入待測樣品50ul于反應孔內。立即加入50ul的*標記的抗體。蓋上膜板,輕輕振蕩混勻,37℃溫育1小時。
甩去孔內液體,每孔加滿洗滌液,振蕩30秒,甩去洗滌液,用吸水紙拍干。重復此操作3次。如果用洗板機洗滌,洗滌次數增加一次。
每孔加入80ul的親和鏈酶素-HRP,輕輕振蕩混勻,37℃溫育30分鐘。
甩去孔內液體,每孔加滿洗滌液,振蕩30秒,甩去洗滌液,用吸水紙拍干。重復此操作3次。如果用洗板機洗滌,洗滌次數增加一次。
每孔加入底物A、B各50ul,輕輕振蕩混勻,37℃溫育10分鐘。避免光照。
取出酶標板,迅速加入50ul終止液,加入終止液后應立即測定結果。
在450nm波長處測定各孔的OD值。


試劑盒性能
1. 靈敏度:zui小的檢測濃度小于1號標準品。稀釋度的線性。樣品線性回歸與預期濃度相關系數R值為0.990。
2. 特異性:不與其它細胞因子反應。
3. 重復性:板內、板間變異系數均小于10%。

ELISA試劑盒結 果 判 斷 與 分 析
1、儀器值:于波長450nm的酶標儀上讀取各孔的OD值

2、以吸光度OD值為縱坐標(Y),相應的ES標準品濃度為橫坐標(X),做得相應的曲線,樣品的ES含量可根據其OD值由標準曲線換算出相應的濃度。

3、檢測值范圍:0-240pg/ml

4、敏感度: 0.1 pg/ml

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