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ELISA試劑盒的優(yōu)化方案

時(shí)間:2014-6-5閱讀:285
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    研究較多的黏附分子主要ELISA試劑盒有免疫球蛋白超家族、整合素家族、選擇性家族、Cadherin家族等。細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)是黏附分子免疫球蛋白超家族中的一員,由內(nèi)皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和上皮細(xì)胞表達(dá),其配體是白細(xì)胞黏附分子CD18家族中的2個(gè)成員:即淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原—1[lymphocyte function-associated antigen-1,LFA-l(CDua/CDls)]和巨噬細(xì)胞抗原復(fù)合體-1[Mac-1(CD11a/CD18)]。正常肝組織中僅竇周細(xì)胞、門靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞有少量ICAM-1表達(dá),肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞多為陰性。炎癥反應(yīng)過程中,ICAM-1是細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)接觸過程中起中心作用的一種細(xì)胞黏附分子,而炎癥細(xì)胞表面的LFA-1與靶細(xì)胞膜上的ICAM-1結(jié)合是*的過程。近年來,白介素ELISA試劑盒許多研究表明:ICAM-1與LFA-l介導(dǎo)的細(xì)胞間黏附,與肝細(xì)胞壞死的發(fā)生有十分密切的關(guān)系,而阻斷它們之間的相互作用或干擾它們的表達(dá)可能成為阻止肝細(xì)胞發(fā)生壞死的一種成功策略。由于ICAM-1與病毒性肝炎關(guān)系的研究是近年來肝病研究領(lǐng)域的新熱點(diǎn),檢測方法和正常參考值的確立尚待完善。

ELISA試劑盒[檢測步驟]
1.使用前先混勻所有試劑,應(yīng)注意避免起泡。
2.確定好空白、標(biāo)準(zhǔn)及待測所需孔數(shù)(每一份標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品、空白及隨機(jī)選擇的對(duì)照應(yīng)測兩次)。
3.從已平衡至室溫的密封袋中取出所需的板條,洗板。
4.加樣,在空白孔、標(biāo)準(zhǔn)品孔中加入100u1樣品稀釋液,在待測孔中加入90u1樣品稀釋液。
5.每份標(biāo)本取10ul加入待測孔中,混勻。
6.在所有孔中加入50ul已稀釋的HRP結(jié)合物,用封板膠紙封住反應(yīng)孔,置于100rpm搖床上室溫環(huán)境中(18~25℃)孵育1h,洗板。
7.在所有孔中加入100ul TMB底物稀釋液,包括空白孔。置于100rpm搖床上,避光室溫環(huán)境中(18~25℃)孵育約10min(視顯色深淺靈活掌握)。
8.加入終止液(100u1/孔)終止反應(yīng),混勻后即刻測量OD450值。
注意:若孵育時(shí)未使用搖床則所獲OD值較低,但仍然有效。
ELISA試劑盒[注意事項(xiàng)]
1.試劑盒從冷藏環(huán)境中取出時(shí)應(yīng)在室溫環(huán)境中平衡30rain后方可使用,未用完的微孔條用自封袋密封保存。
2.酶標(biāo)板洗滌時(shí)各孔均需加滿洗滌液,防止孔內(nèi)有游離酶不能洗凈。應(yīng)設(shè)定30~60s的洗滌浸泡時(shí)間。
3.滴加試劑前應(yīng)將滴瓶翻轉(zhuǎn)數(shù)次,使液體混勻。滴加時(shí)瓶身應(yīng)保持垂直,以使滴量準(zhǔn)確。
4.所有樣品和廢棄物都應(yīng)按傳染源處理。終止液為2mol/L硫酸,使用時(shí)應(yīng)注意安全。
5.每批樣本應(yīng)同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線。
6.若標(biāo)本OD值在標(biāo)準(zhǔn)曲線測定范圍以外,應(yīng)適當(dāng)稀釋后重測。

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