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大腸桿菌電轉化感受態細胞制備流程及轉化方法

時間:2015/6/25閱讀:710
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*天:

1. 將適合菌株(XL1-Blue, DH5α)置于LB或其他營養豐富的培養基上,在37°C下隔夜培養;

2. 高溫滅菌大的離心瓶(250-500ml)以備第二天搖瓶用;

3. 準備幾瓶滅菌水(總量約1.5),保存于冷凍室中以備第二天重懸浮細胞用;

第二天:

4. 轉移0.2-1ml隔夜培養物至裝有500ml LB(或其他營養豐富的培養基)1-2升搖瓶;

5. 37°C下劇烈振蕩培養2-6小時;

6. 定時監控OD600(培養1小時后每半小時測定一次;

7. OD600值達到0.5-1.0時,從搖床中取出搖瓶,置于冰上冷卻至少15分鐘(需要的話這種方式可以存放培養液數小時;

8. 細胞在4°C 5000g下離心15分鐘,棄上清液(如需要,沉淀可在4°C10%甘油中保存一兩天)

9. 用滅菌的冰水重懸浮細胞。先用渦旋儀或吸液管重懸浮細胞于少量體積中(幾毫升),然后加水稀釋至離心管的2/3體積;

10. 照上面步驟重復離心,小心棄去上清液;

11. 照上面步驟用滅菌的冰水重懸浮細胞;

12. 離心,棄上清液;

13. 20ml滅菌的、冰冷后的10%甘油重懸浮細胞;

14. 照上面步驟離心,小心棄去上清液(沉淀可能會很松散)

15. 10%甘油重懸浮細胞至zui終體積為2-3ml

16. 將細胞按150μl等份裝入微量離心管,于-80°C保存。

轉化方法:

1. 在冰上解凍電感受態細胞添加1-10μl DNA,冰上培育約5分鐘;

2. 添加1-3μl DNA,冰上培育約5分鐘;

3. 轉移DNA/細胞混合物至冷卻后的2mm電穿孔容器(無泡)中;

4. 加載P1000,準備好300μl LB 2xYT

5. 對電穿孔容器進行脈沖(200 歐姆, 25μFd2.5 千伏)(檢查時間常數,應該在3以上)

6. 立即添加300μl LB2xYT至電穿孔容器中;

7. 37°C下培養細胞40分鐘至1小時以復原;

8. 轉移細胞至適當的選擇培養基上培養。


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