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無血清培養基的使用方法

時間:2015/7/13閱讀:404
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    目前,血清仍是動物細胞培養中zui基本的的添加物,尤其是在原代培養或者細胞生長狀況不良時,常常會先使用有血清的培養液進行培養,待細胞生長旺盛以后,再換成無血清培養液。細胞轉入無血清培養基培養要有一個適應過程,一般要逐步降低血清濃度,從10%減少到5%3%1%,直至無血清培養。在降低過程中要注意觀察細胞形態是否發生變化,是否有部分細胞死亡,存活細胞是否還保持原有的功能和生物學特性等。在實驗后這些細胞一般不再繼續保留,很少有細胞能夠長期培養于無血清培養基而不發生改變的。細胞轉入無血清培養之前,要留有種子細胞,種子細胞按常規培養于含血清的培養基中,以保證細胞的特性不發生變化。

    為了使細胞適應無血清培養,關鍵的是使所培養細胞: 
    ●處于對數生長中期 
    ●>90% 活細胞率 
    ●適應時以較高的起始細胞接種

    有兩種方法使細胞適應無血清培養基:

    1. 直接適應——細胞從添加血清的培養基轉換到無血清培養基中。 
一些類型細胞可直接從包含血清的培養基適應無血清培養基。對于直接適應,接種細胞密度應該:2.5×105~3.5×105細胞/ml。當細胞密度達到1×106~3×106細胞/ml時,傳代培養細胞。當細胞密度在培養47天后達到2×106~4×106細胞/ml時,細胞*適應了無血清培養基。每隔3~5天,當細胞密度達到1×106~3×106細胞/ml,細胞活率在90%時,貯備的適應了無血清培養基的細胞培養物應該再次傳代培養。

    2. 連續適應——分好幾步把細胞從添加血清的培養基轉換到無血清培養基(SFM)中,與直接適應相比較,連續適應趨向對于細胞更加溫和一些。 
    ●2倍正常接種密度接種生長活躍的細胞培養物到75%有血清培養基:25SFM 混合培養基中,傳代培養。 
    ●當細胞密度>5×105細胞/ml時,以2×1053×105細胞/ml細胞密度,在有血清培養基:SFM5050的混合培養基中傳代培養。 
    ●2×1063×106細胞/ml細胞密度,25%有血清培養基和75% SFM中傳代培養。 
    ●當細胞密度達到1×1063×106細胞/ml(接種后46天),在100SFM培養基中傳代培養。 
    ●每隔35天,當細胞密度達到1×1063×106細胞/ml,細胞活率在90%時,貯備的適應了無血清培養基的細胞培養物應該再次傳代培養。 
建議備份前一次混合培養的培養物,直到每一次細胞適應了新的混合培養基。每一次減少血清前,可能需要在SFM/有血清混合培養基中進行幾次傳代。

    在適應過程中,不要讓細胞生長過度。這將增加選擇亞群的可能性。需要注意,與有血清培養基相比,大部分SFM包含非常少的蛋白質,因而更易于受外界因素的影響。細胞培養適應替代血清:許多細胞利用連續適應方法能很好的適應,用包含FBS的的培養基和包含有替代血清的培養基11vv)的混合培養基培養細胞。通過下列的混合培養基的方式,連續幾代減少當前培養基的量:1214116100%替代培養基。每次適應改變血清比例時,傳代細胞23次。培養可以直接從FBS轉換到替代血清。一開始就使用相同于FBS的濃度的替代物或血清,生長的延遲可能會發生,4允許進行23次的傳代,使生長率恢復到以前的水平。特別需要強調的是:配制無血清培養液必須使用高質量的水,如石英玻璃蒸餾器經三次蒸餾或超純水凈化裝置制備的水。因為無血清培養基缺乏了血清中天然成分中和毒素、保護細胞的大分子,既便水中的有毒物質含量甚微,也可能對細胞產生致死性損害。這是無血清培養能否成功的關鍵因素之一。

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