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ELISA試劑盒方法與硝酸纖維素膜微粒介紹

時間:2015/9/7閱讀:361
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實驗方法
1.1 混合抗原直接測試 
    按豚鼠膜迷路蛋白抗原性分析文章講述的方法,將1.2ml大鼠原血清加入7.0ml10%丙烯酰胺溶液,聚合后在10°C200mA2h條件下大鼠血清蛋白電泳吸附于NC膜,用蒸餾水漂洗后,切一10×100mm小條裝入10ml試管備用。對照組將同樣面積空白NC膜用蒸餾水漂洗后備用。ELISA試劑盒上述裝有NC膜的試管中加入10ml DMSO,充分搖勻,室溫1h;加入等體積01molL pH90*溶液,充分混勻。3000rmin離心35min,收集沉淀,即為含大鼠血清蛋白的NC膜微粒,用001molL pH7.4 PBS-T洗滌離心3×5min;用含0.3%的150正常羊血清封閉、阻斷37°C30min4°C冰箱;同上離心后用PBS將微粒體積調至5ml、用0.5ml離心管分裝,每管加入100μl微粒懸濁液;在各管中分別加入100μl倍比稀釋的HRP-羊抗鼠,37°C孵育30min;同上洗滌離心3次,加入100μl0.1molL檸檬酸、0.2molL*、雙氧水、鄰苯二胺底物溶液,于37°C暗環境反應120min;每管加入12molL硫酸終止反應,同上離心,收集上清并加入96ELISA試劑盒酶聯板,用酶標儀測試波長490nmOD值。重復測試3次。
1.2 電泳分離抗原測試 
    首先免疫轉印鑒定抗原,ELISA試劑盒再根據免疫轉印結果進行定位,將特定抗原帶裁下,測量NC膜面積,同上將NC膜微粒化處理并進行定量免疫測試。
2 實驗結果
    用混合抗原直接測試和用電泳分離抗原進行測試,抗體濃度與OD值間均有較好線性關系,當抗體濃度為0.2510ngml時線性,且陽性組和陰性對照組OD值落在*范圍,即陰性對照組OD值為0.3左右,陽性對照組為1.0左右。3次重復結果一致。
3 討論
    ELISA法進行測試時,包被條件非常關鍵,對用于包被的抗原或抗體要求較高,其應用范圍受限制。NC膜具有很強的吸附能力,從而出現了以該材料為基礎的斑點免疫檢測法。其對被吸附的抗原要求不高,粗制抗原便可用于檢測,但吸附時間長、費時,被吸附抗原如果含有表面活性劑便不能用于檢測。為了克服上述缺點,我們曾建立了一種電泳吸附斑點免疫法,但該法需要將NC膜逐一截成小圓片放入酶聯板中,操作也不方便,定量不夠準確。NCMPE法將電泳吸附抗原的NC膜變成微顆粒,分裝方便,能保證其均一性,定量準確,由于在離心管中操作、洗滌等處理極為方便。免疫轉印技術是抗原抗體檢測方面的重大突破,但應用該方法難以將抗體定量。NCMPE法將免疫轉印識別的特定抗原帶處理成微顆粒,然后用ELISA試劑盒法定量測試抗體水平,充分發揮了免疫轉印技術的高分辨率和ELISA定量法的高度性與高度靈敏性,可極為方便而準確地將某種未知抗體定量。


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