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江蘇科特商貿有限公司
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瓊脂糖凝膠的制備

時間:2014-12-16閱讀:615
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1、取5×TBE緩沖液20ml加水至200ml,配制成0.5×TBE稀釋緩沖液,待用。
2、膠液的制備:稱取0.4g瓊脂糖,置于200ml錐形瓶中,加入50ml 0.5×TBE稀釋緩沖液,放入微波爐里(或電爐上)加熱至瓊脂糖全部熔化,取出搖勻,此為0.8%瓊脂糖凝膠液。加熱過程中要不時搖動,使附于瓶壁上的瓊脂糖顆粒進入溶液。加熱時應蓋上封口膜,以減少水份蒸發。
3、灌膠:將有機托盤放入制膠模具上,插上樣品梳子,注意觀察梳子齒下緣應與膠槽底面保持1mm左右的間隙。
向冷卻至50-60的瓊脂糖膠液中加入溴化乙錠(EB)溶液使其終濃度為0.5μg /ml(也可不把EB加入凝膠中,而是電泳后再用0.5μg/mlEB溶液浸泡染色)。將瓊脂糖小心地倒入膠槽內,使膠液形成均勻的膠層。倒膠時的溫度不可太低,否則凝固不均勻,速度也不可太快,否則容易出現氣泡。待膠*凝固后撥出梳子,注意不要損傷梳底部的凝膠,然后向槽內加入0.5×TBE稀釋緩沖液至液面恰好沒過膠板上表面。因邊緣效應樣品槽附近會有一些隆起,阻礙緩沖液進入樣品槽中,所以要注意保證樣品槽中應注滿緩沖液。
4、加樣:取10μl酶解液與2μl 6×載樣液混勻,用微量移液槍小心加入樣品槽中。若DNA含量偏低,則可依上述比例增加上樣量,但總體積不可超過樣品槽容量。每加完一個樣品要更換tip,以防止互相污染,注意上樣時要小心操作,避免損壞凝膠或將樣品槽底部凝膠刺穿。
5、電泳:加完樣后,合上電泳槽蓋,立即接通電源。控制電壓保持在60-80V,電流在40mA以上。當溴酚藍條帶移動到距凝膠前沿約2cm,停止電泳。
6、染色:未加EB的膠板在電泳完畢后移入0.5μg/mlEB溶液中,室溫下染色20-25分鐘。
7、觀察和拍照:在波長為254nm的長波長紫外燈下觀察染色后的或已加有EB的電泳膠板。DNA存在處顯示出肉眼可辨的桔紅色熒光條帶。紫光燈下觀察時應戴上防護眼鏡或有機玻璃面罩,以免損傷眼睛。經照相機鏡頭加上近攝鏡片和紅色濾光片后將相機固定于照相架上,采用全色膠片,光圈5.6,曝光時間10-120(根據熒光條帶的深淺選擇)

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