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初級(jí)會(huì)員 | 第10年

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免疫組化染色呈陰性結(jié)果的原因有哪些?

時(shí)間:2019/5/8閱讀:617
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ELISA試劑盒免疫組化染色呈陰性結(jié)果的原因有哪些?

1、抗體濃度和質(zhì)量問題以及抗體來源選擇錯(cuò)誤。不知抗體是進(jìn)口的還是國產(chǎn)的工作液,怎么這么高稀釋度也沒能做出陽性結(jié)果?另外,不是抗體濃度越高就越易出現(xiàn)陽性結(jié)果,抗原抗體反應(yīng)有前帶和后帶效應(yīng),必須摸索Z佳濃度。

2、抗原修復(fù)不全,對于甲醛固定的組織必須用充分抗原修復(fù)來打開抗原表位,以利于與抗體結(jié)合;建議微波修復(fù)用高火4次*6min試試。有人做過實(shí)驗(yàn),這是Z佳的時(shí)間和次數(shù)。若不行,還可高壓修復(fù)。

3、組織切片本身這種抗原含量低;

4、血清封閉時(shí)間過長。

5、DAB孵育時(shí)間過短。

6、細(xì)胞通透不全,抗體未能充分進(jìn)入胞內(nèi)參與反應(yīng)。

7、開始做免疫組化,我建議你一定要首先做個(gè)陽性對照片,排除抗體等外的方法問題。

我的實(shí)際解決方案:

1、首先,排除組織切片內(nèi)的抗原有無丟失及其含量多少。免疫組化中兩個(gè)Z重要的因素是抗原和抗體。(1)抗原有無丟失主要看組織切片的新鮮程度,一般切片室溫保存超過3-6個(gè)月,可能切片內(nèi)的抗原丟失很嚴(yán)重(有文獻(xiàn)支持),此時(shí)可以通過重新用石蠟塊切片來進(jìn)一步驗(yàn)證(蠟塊需要低溫保存)。(2)石蠟切片在制作過程中可能因醛基對抗原決定族的封閉,這需要通過抗原修復(fù)來充分暴露,從而增加抗原抗體結(jié)合反應(yīng),提高陽性率,我一般用6min*4次中火微波抗原修復(fù),用枸櫞酸鈉緩沖液。(3)組織切片中本身抗原含量的多少?這方面我有教訓(xùn)的,我做胎鼠睪wa間質(zhì)細(xì)胞鑒定,用1:200一抗效果很好;但我用1:200一抗孵育成年睪wa間質(zhì)細(xì)胞檢測,幾乎呈陰性,后來證實(shí)是因?yàn)閮烧呖乖肯嗖钌踹h(yuǎn),則一抗也要適當(dāng)提高濃度。

2、其次,檢查抗體有無選擇錯(cuò)誤和抗體孵育條件是否不適。(1)一抗選擇單克隆抗體易出現(xiàn)陰性結(jié)果,因?yàn)殪`敏度低但特異性好;一抗的species reactivity中無檢測組織的種屬,這是比較常見的錯(cuò)誤;一抗選擇rat,而二抗是抗mouse/rabbit等均有可能出現(xiàn)陰性結(jié)果。(2)抗體孵育時(shí)間過短,容易導(dǎo)致陰性結(jié)果。一般一抗我建議4度孵育和37度復(fù)溫45min;二抗我一般37度30min。我不喜歡參照二抗染色試劑盒說明書。(3)抗體濃度過低。這是陰性結(jié)果的Z可能原因。必須提高稀釋度,我一般初次做一種新抗體,喜歡先用說明書建議的低濃度和高濃度做一次,然后決定是向高還是低方向摸索。一般先決定二抗的濃度(工作液就好辦了,直接滴加),重點(diǎn)摸索一抗的Z適濃度。注意:免疫反應(yīng)中存在前帶和后帶效應(yīng),這提示不是濃度越高,陽性率就越高,反之亦然。(4)重要原因排除之后,也不要忽視抗體的質(zhì)量:原裝抗體一般比較穩(wěn)定,效果較好;而進(jìn)口分裝次之;工作液可能要注意質(zhì)量問題。

3、同時(shí),DAB的孵育時(shí)間可能要適當(dāng)延長,在鏡下觀察,有時(shí)可延長至30min。但一般3-10min,此時(shí)背景也較淺。否則,說明抗體濃度不合適。

4、Z后,血清封閉時(shí)間也可相應(yīng)縮短。一般10-30min,但這個(gè)時(shí)間可以調(diào)整,封閉主要是降低切片的總體背景著色。

5、此外,細(xì)胞通透也不可忽視。許多戰(zhàn)友認(rèn)為石蠟切片一般不需細(xì)胞通透,因?yàn)榍衅瑫r(shí)可能已經(jīng)把細(xì)胞切開了,但對于胞核蛋白,建議還是通透一下,促進(jìn)抗體等試劑充分進(jìn)入?yún)⑴c反應(yīng)。

6、以上原因,都是針對實(shí)際中常見原因來進(jìn)行分析的,前提是排除操作者的操作錯(cuò)誤而引起陰性結(jié)果,這就需要新手還是要設(shè)置陽性對照以排除方法的問題。還有抗體稀釋液的PH值過低等其它原因的干擾。

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