小鼠肝星狀細胞永生化細胞專用培養基操作步驟：

在完成培養基配制后，需進行無菌分裝至培養瓶或培養皿中，避免長時間暴露于空氣中。分裝時建議在超凈工作臺內操作，使用0.22 μm濾膜過濾后的培養基可進一步降低污染風險。若需長期保存，可分裝為50 mL/管，置于4℃避光儲存，建議兩周內使用完畢，以維持營養成分的穩定性。

接種永生化的小鼠肝星狀細胞前，需先用預熱的PBS輕柔洗滌細胞2-3次，以去除殘留的血清或消化酶。采用0.25%（含EDTA）在37℃下消化30-60秒，加入含血清的培養基終止反應，離心后重懸細胞，調整密度至5×10?~1×10? cells/mL。接種時注意均勻鋪板，避免局部堆積影響細胞貼壁。

培養條件需嚴格控制在37℃、5% CO?的恒溫培養箱中，濕度維持在90%以上。換液建議在接種后24小時進行，此后每48-72小時更換一次新鮮培養基。若細胞密度超過80%，需及時傳代，傳代比例通常為1:2至1:3，以保持細胞良好的增殖狀態。

為監測細胞狀態，可定期在倒置顯微鏡下觀察形態：永生化肝星狀細胞應呈現梭形或多角形，胞質透亮，偽足明顯。若出現顆粒增多或收縮圓化，可能提示培養環境異常。必要時可通過α-SMA免疫熒光染色或CCK-8增殖實驗進一步驗證細胞活性。

**注意事項**：

1. 避免反復凍融培養基，分裝后標注配制日期；

2. 傳代時消化時間不宜過長，防止細胞損傷；

3. 培養過程中出現污染需立即廢棄并消毒操作區。

通過上述標準化操作，可確保永生化肝星狀細胞的穩定生長，為后續肝纖維化機制研究或藥物篩選提供可靠模型。