原代細(xì)胞轉(zhuǎn)染目前已經(jīng)成為研究和控制真核細(xì)胞基因表達(dá)的重要手段。本文整理了一些關(guān)于轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備工作及一些實(shí)驗(yàn)過程中的小貼士，希望這些信息能夠幫助各位科研君們做好轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)及提高實(shí)驗(yàn)效率。

① 從健康細(xì)胞開始
Ⅰ 轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)前，細(xì)胞解凍后傳代3–4次。 這使得細(xì)胞從解凍過程中恢復(fù)過來，并恢復(fù)正常的生長速度。
Ⅱ 僅使用活性 >90%的細(xì)胞——使用臺盼藍(lán)染色可輕松測定細(xì)胞活性。
Ⅲ 定期傳代細(xì)胞，切勿讓細(xì)胞長到匯合狀態(tài)或過度生長。如果讓細(xì)胞長到匯合狀態(tài)，可能會改變細(xì)胞的生長速度以及形態(tài)。
a. 請在匯合率達(dá)到90%之前對細(xì)胞進(jìn)行傳代。我們建議您使用胰酶替代物Cellstripper™試劑(Corning 25-056-CI)使細(xì)胞脫壁。Cellstripper™試劑可于室溫下存儲在通風(fēng)櫥中。可通過添加過量的Cellstripper™來跳過PBS洗滌的步驟，然后吸棄全部液體，僅留可覆蓋瓶子表面的液體。
* 非酶類細(xì)胞分離溶液，其配方是螯合劑的配方，可溫和分離組織培養(yǎng)物的貼壁細(xì)胞。性質(zhì)比胰酶更溫和。
b. 傳代條件取決于所用的細(xì)胞系。 部分經(jīng)驗(yàn)法則：
對于快速生長的細(xì)胞，倍增時間為16小時(如HEK-293)，按1：10的比例分瓶。
對于生長緩慢的細(xì)胞，倍增時間為36小時(如原代細(xì)胞)，按1：5的比例分瓶。
Ⅳ 保留凍存的細(xì)胞系，并定期解凍新細(xì)胞。 傳代次數(shù)高(>30–40)時，細(xì)胞的生長速度和形態(tài)會改變。

② 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)之前，請先規(guī)劃您的實(shí)驗(yàn)。
務(wù)必要熟悉實(shí)驗(yàn)方案、確定所需的材料量，并在開始實(shí)驗(yàn)前確認(rèn)所需的一切物品條件均已齊備。
Ⅰ 開始前，設(shè)計好鋪板路線圖，標(biāo)注好每次處理或?qū)嶒?yàn)條件。
Ⅱ 計算所需脂質(zhì)體和DNA的儲備量，并確認(rèn)有足夠的下列材料：TransfectGRO減血清培養(yǎng)基(Corning 40-300-CVR)，Lipofectamine® 2000 或Lipofectamine® LTX試劑，以及DNA (0.5–1 µg/µL)。

③ 轉(zhuǎn)染時，請使用DNA。
Ⅰ 使用無內(nèi)毒素的試劑盒和實(shí)驗(yàn)方案制備DNA。
Ⅱ 通過測量OD 260/280值來確定DNA純度，測得的OD值應(yīng)介于1.7–1.9]之間。數(shù)值過高或過低均說明有雜質(zhì)，不宜用于轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。
Ⅲ 在無DNA/RNA酶的水或TE中稀釋DNA。
Ⅳ 原代細(xì)胞制備的工作濃度為0.5–1 µg/µL。 可用SpeedVac®濃縮儀或透析過濾裝置(例如，Millipore Amicon®超濾管)來濃縮DNA。

④ 轉(zhuǎn)染當(dāng)天，將細(xì)胞鋪板。
Ⅰ 如果在轉(zhuǎn)染前一天或更早時間鋪板，轉(zhuǎn)染效率可能下降。
Ⅱ 轉(zhuǎn)染時，細(xì)胞密度保持在匯合率為70–90%。
Ⅲ 轉(zhuǎn)染時，細(xì)胞密度影響轉(zhuǎn)染效率。 為了簡化轉(zhuǎn)染優(yōu)化過程或節(jié)省時間，我們建議細(xì)胞鋪成2種不同的密度，以確保較高的轉(zhuǎn)染效率。
Ⅳ 細(xì)胞的鋪板和轉(zhuǎn)染可同時進(jìn)行，或者通過反向轉(zhuǎn)染操作進(jìn)行。 反向轉(zhuǎn)染操作中，使用的細(xì)胞是正常/正向轉(zhuǎn)染的2.5倍以上。
Ⅴ 轉(zhuǎn)染復(fù)合物可以加到含抗生素和血清的培養(yǎng)基中，且不會影響轉(zhuǎn)染效率。

⑤ 準(zhǔn)備脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物。
Ⅰ 為了獲得的試驗(yàn)結(jié)果，我們建議在TransfectGRO培養(yǎng)基中混合脂質(zhì)體和DNA。 另一種方法是使用無血清培養(yǎng)基。
Ⅱ 在TransfectGRO培養(yǎng)基中稀釋脂質(zhì)體。 在第二管Opti-MEM®培養(yǎng)基中稀釋DNA，然后和等體積脂質(zhì)體溶液混合。 該2步稀釋法可獲得更的數(shù)據(jù)，比脂質(zhì)體直接加入稀釋的DNA中的方法獲得的結(jié)果更有重復(fù)性。
Ⅲ 脂質(zhì)體一旦在TransfectGRO培養(yǎng)基中稀釋，在加入稀釋的DNA之前，孵育時間為2- 5分鐘。 稀釋的脂質(zhì)體孵育時間不要超過20]分鐘。
Ⅳ DNA的TransfectGRO溶液更加穩(wěn)定，Z早可以提前4小時制備，但不要太早。
Ⅴ 等體積稀釋的脂質(zhì)體和DNA溶液等體積混在一起后，通過緩慢地上下吹打來混合溶液，也可輕彈試管底部，或者快速渦旋混合。
Ⅵ 脂質(zhì)體/DNA復(fù)合物溫育5-10小時后，將復(fù)合物轉(zhuǎn)移到含有細(xì)胞和生長培養(yǎng)基的孔中。 將復(fù)合物滴加到培養(yǎng)基上，然后輕輕地晃動板子。 切勿劇烈地將孔中的脂質(zhì)體/DNA復(fù)合物分散，否則會使細(xì)胞移位。

⑥ 利用含GFP或LacZ之類報告基因的質(zhì)粒作為陽性對照，評估轉(zhuǎn)染效率。
利用顯微鏡(例如FLoid™細(xì)胞成像工作站)或流式細(xì)胞儀(例如Attune®聲波聚焦流式細(xì)胞儀)可輕松測定轉(zhuǎn)染細(xì)胞和GFP蛋白表達(dá)細(xì)胞的百分比。 可使用ToxBLAzer™試劑盒來測定LacZ基因的表達(dá)。
Ⅰ 轉(zhuǎn)染后24-48小時，應(yīng)該可以看到或檢測到質(zhì)粒的表達(dá)。
Ⅱ 原代細(xì)胞陽性對照可以放在一個單獨(dú)的孔中，或是與感興趣的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染。 共轉(zhuǎn)染過程中，在加入稀釋的脂質(zhì)體之前，可在TransfectGRO培養(yǎng)基中將50–100ng帶GFP的質(zhì)粒和100 ng感興趣的質(zhì)粒混合。