ATCC細(xì)胞房工作守則及注意事項(xiàng)
一、 常規(guī)操作
    1. 穿著實(shí)驗(yàn)服。自己的白大衣或厚外套，可脫在門(mén)外的衣帽架上。
2. 穿著拖鞋。在緩沖間換下自己的鞋子，盡量避免在緩沖間走動(dòng)、停留。
3. 細(xì)胞房Z多可4個(gè)人同時(shí)使用。盡量避免在內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間逗留、交談。
二、 培養(yǎng)箱使用規(guī)則
    1. 從培養(yǎng)箱取放物品前，用酒精清潔雙手（或手套），盡量縮短開(kāi)門(mén)時(shí)間和減少開(kāi)門(mén)次數(shù)。
注： 培養(yǎng)箱中的空氣是經(jīng)過(guò)過(guò)濾的潔凈空氣。長(zhǎng)時(shí)間敞開(kāi)或頻繁開(kāi)關(guān)培養(yǎng)箱，容易造成污染。
2. 培養(yǎng)瓶皿放入培養(yǎng)箱前，用酒精消毒表面，并稍等至酒精揮發(fā)后再放入，以免培養(yǎng)箱內(nèi)滯留過(guò)多乙醇蒸氣。
3. 2-3人共用一層培養(yǎng)箱，按預(yù)定位置擺放培養(yǎng)器皿，方便查找，以免長(zhǎng)時(shí)間敞開(kāi)培養(yǎng)箱。
4. 普通培養(yǎng)中的細(xì)胞，若非實(shí)驗(yàn)需要，每瓶/板細(xì)胞每天只需要觀察生長(zhǎng)狀態(tài)一次，2人以上共用的細(xì)胞，可約好時(shí)間一起觀察。
注：頻繁將細(xì)胞拿出觀察，容易給培養(yǎng)箱造成污染，同時(shí)也會(huì)影響細(xì)胞生長(zhǎng)條件的恒定。
三、 顯微鏡使用規(guī)則
    1. 顯微鏡使用前，用酒精棉從中間至周?chē)潦幂d物臺(tái)。
2. 離開(kāi)細(xì)胞房時(shí)或較長(zhǎng)時(shí)間不需使用時(shí)，及時(shí)關(guān)上電源，延長(zhǎng)燈泡壽命。盡量避免頻繁開(kāi)關(guān)顯微鏡電源。
四、 超凈臺(tái)相關(guān)操作規(guī)則
    1. 超凈臺(tái)使用遵循預(yù)約原則。無(wú)預(yù)約者若有必要在他人預(yù)約時(shí)段內(nèi)使用，需先征得預(yù)約者的同意，否則應(yīng)無(wú)條件讓出工作臺(tái)，以免耽誤他人實(shí)驗(yàn)。
    2. 超凈臺(tái)使用前用紫外燈照射15分鐘滅菌，使用前、后需用酒精棉球擦拭工作區(qū)消毒，所有物品放入超凈臺(tái)內(nèi)使用前均應(yīng)消毒。
    3. 點(diǎn)燃酒精燈前需檢查瓶中酒精是否足夠，液面應(yīng)占瓶高1/3-2/3。
注： 消毒用75%的酒精，酒精燈用95%的酒精，向噴壺或燈內(nèi)添加酒精時(shí)請(qǐng)留意。
注： 酒精和酒精棉球由值日生負(fù)責(zé)補(bǔ)給，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞房?jī)?nèi)存放量不足時(shí)請(qǐng)及時(shí)通知值日生。
    4. 超凈臺(tái)中應(yīng)擺放廢液杯和廢品杯各一只，用于暫時(shí)存放廢棄物，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后將杯內(nèi)垃圾倒入水池或垃圾桶中，并沖洗晾干備用。
注： 將廢棄的槍頭、管子內(nèi)的殘留液體打入廢液杯后再棄入廢品杯中，以免垃圾桶內(nèi)留有大量培養(yǎng)液滋生細(xì)菌。
    5. 可回收的移液管、離心管、培養(yǎng)瓶皿等，放入裝有清水的塑料桶中浸泡，桶內(nèi)需有足量的清水以沒(méi)過(guò)浸泡物品。
注： 可回收器皿必要時(shí)先初步涮洗后再放入桶內(nèi)，尤其是培養(yǎng)瓶或血清管中有大量高營(yíng)養(yǎng)的液體殘留時(shí)，容易使桶內(nèi)的清水長(zhǎng)菌。
保證浸泡的瓶、管內(nèi)*被清水充滿，而不是在裝有大量空氣的情況下被壓倒桶底。
塑料桶內(nèi)物品由值日生每天負(fù)責(zé)送去清洗，使用者實(shí)驗(yàn)結(jié)束后若發(fā)現(xiàn)桶已裝滿，請(qǐng)通知值日生或順手將塑料桶帶出細(xì)胞房。
    6. 裝培養(yǎng)液的瓶子、配培養(yǎng)液的器皿勿放入塑料桶內(nèi)浸泡！應(yīng)由使用者本人及時(shí)清洗晾干備用。
注： 因桶內(nèi)物品通常要浸泡幾小時(shí)以上才送去清洗，此時(shí)細(xì)菌可能已在桶中生長(zhǎng)并釋放內(nèi)毒素。細(xì)菌內(nèi)毒素很難通過(guò)常規(guī)濕熱滅菌步驟去除干凈，即使干烤也不能保證其*失活。內(nèi)毒素對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)及多種實(shí)驗(yàn)均有較大影響。
   ATCC細(xì)胞洗滌程序：洗潔精洗凈，清水沖十次以上去除洗滌劑殘留，然后沖去離子水3次，再用雙蒸水1次，倒置于器皿柜中晾干。關(guān)上器皿柜的門(mén)防塵。
五、 培養(yǎng)液、試劑等相關(guān)操作規(guī)則
    1. 從冰箱取放物品動(dòng)作要迅速，關(guān)門(mén)時(shí)要檢查門(mén)是否關(guān)好。按類(lèi)別存放試劑。
    2. 培養(yǎng)液母液是公用，由值日生負(fù)責(zé)配制，長(zhǎng)期存放于-20℃。使用時(shí)按比例加入血清配成培養(yǎng)液工作液，打開(kāi)使用后的母液存放于4℃，要注意避免污染。發(fā)現(xiàn)4℃存放的培養(yǎng)液量不足時(shí)及時(shí)從-20℃中預(yù)解凍，若-20℃中已沒(méi)有儲(chǔ)備，請(qǐng)及時(shí)通知值日生。
3. 分裝好的血清長(zhǎng)時(shí)間保存于-20℃，使用前放于4℃預(yù)解凍。從-20℃取用血清者需登記，并在血清管上簽上使用者名字，若使用別人解凍的血清需征得同意以免耽誤他人實(shí)驗(yàn)。按需解凍，避免反復(fù)凍融。
4. 原則上解凍好的血清應(yīng)全部配成含血清的培養(yǎng)基備用，若有剩余，則暫存于4℃并盡快使用。盡量不要使用他人開(kāi)過(guò)的血清，以免交叉污染。
六、 值日生工作職責(zé)
    1. 每周值日生時(shí)間從周六開(kāi)始，至下周五結(jié)束。
2. 值日周開(kāi)始時(shí)需做的事情：在周六、日或之前準(zhǔn)備好滅菌的槍頭、離心管、干烤好的玻璃器皿，供未來(lái)一周的使用。配制消毒用的75%的酒精，制作酒精棉球，給細(xì)胞房?jī)?nèi)添加足夠的95%乙醇供酒精燈使用。
注： 新離心管滅菌前，先用去離子水過(guò)2-3次，再用雙蒸水沖1次，烘干后用牛皮紙包好、滅菌。
注：75%的酒精可用750ml 95%的酒精加去離子水至950ml配制而成。
3. 值日周內(nèi)每天需做的事情：開(kāi)大紫外燈消毒細(xì)胞房15-30min；將裝滿浸泡物品的塑料桶拎出細(xì)胞房送洗，并將空桶放回細(xì)胞房；更換垃圾袋；檢查培養(yǎng)箱內(nèi)水量是否足夠；檢查滅菌物品的儲(chǔ)備情況，以便及時(shí)補(bǔ)充；檢查培養(yǎng)液母液、血清、酒精等公用試劑的儲(chǔ)備情況。
4. 值日周結(jié)束前需完成的事情：星期五或前后一天內(nèi)打掃細(xì)胞房。包括拖地，擦桌子、吊柜、清潔和整理抽屜，擦超凈臺(tái)、冰箱及桌上的儀器，給水浴鍋加水或換水，洗細(xì)胞房的實(shí)驗(yàn)服和拖鞋，紫外消毒細(xì)胞房。切記給培養(yǎng)箱換MilliQ水，保證水質(zhì)清潔！
注：若上周值日生及時(shí)給培養(yǎng)箱內(nèi)水槽加足水，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)未來(lái)一周內(nèi)培養(yǎng)箱不會(huì)干水，但值日生仍應(yīng)經(jīng)常檢查，以便及時(shí)發(fā)現(xiàn)異常情況。
5. 每2周清潔一次培養(yǎng)箱：先將培養(yǎng)箱中的物品取出暫存于超凈臺(tái)內(nèi)，對(duì)于比較敏感的細(xì)胞可以暫存于404細(xì)胞房的培養(yǎng)箱；將培養(yǎng)箱內(nèi)的不銹鋼板取出，包括4塊橫板和左右2塊立著的架子，用酒精棉球清潔鋼板和培養(yǎng)箱內(nèi)壁；打開(kāi)培養(yǎng)箱清潔內(nèi)壁時(shí)動(dòng)作要迅速，避免長(zhǎng)時(shí)間敞開(kāi)門(mén)使得大量不潔凈空氣進(jìn)入，縮短過(guò)濾器的壽命；用紫外燈照射培養(yǎng)箱內(nèi)部15min，手提紫外燈放入培養(yǎng)箱前要用酒精棉擦拭干凈。
6. 配制培養(yǎng)液母液：培養(yǎng)液有RPMI1640和DMEM兩種，配方見(jiàn)404公共配液房；配制培養(yǎng)基要提前干烤量筒、燒杯、250ml血清瓶，濕熱滅菌濾器、血清瓶瓶蓋，國(guó)產(chǎn)濾膜使用前用MilliQ水浸泡15min以上或過(guò)夜。
七、常用溶液的配制
    1. RPMI 1640：干粉一包，碳酸氫鈉 2.0g，Hepes 2.38g，青霉素100u/ml，鏈霉素100ug/ml，攪拌1-2小時(shí)后調(diào)節(jié)pH值至7.2，定容至1L，過(guò)濾滅菌分裝；
2. DMEM：干粉一包，碳酸氫鈉 3.7g，Hepes 2.38g，丙酮酸鈉110mg，青霉素100u/ml，鏈霉素100ug/ml，攪拌1-2小時(shí)后調(diào)節(jié)pH值至7.2，定容至1L，過(guò)濾滅菌分裝；
3. 胰蛋白酶：用D-Hanks配制，濃度為0.25％(W/V), 攪拌2小時(shí)后調(diào)節(jié)pH值至7.2，定容至1L，過(guò)濾滅菌分裝；
4. 青霉素：80萬(wàn)單位/瓶，加入4ml PBS，配成濃度為200000U/ml的母液；
5. ATCC細(xì)胞鏈霉素：按質(zhì)量體積比配制，用PBS配成濃度為200mg/ml的母液。