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技術(shù)文章

酶聯(lián)免疫吸附測定類型與操作步驟

閱讀:362發(fā)布時間:2017-8-2

雙抗體夾心法檢測抗原

雙抗體夾心法是檢測抗原zui常用的辦法,但要留意的是在一步法(待測抗原與酶標(biāo)抗體一同參加反響)測定中,當(dāng)標(biāo)本中受檢抗原的含量很高時,過量抗原別離和固相抗體及酶標(biāo)抗體,而不再構(gòu)成“夾心復(fù)合物”呈現(xiàn)鉤狀效應(yīng),乃至可不顯色而呈現(xiàn)假陰性成果。因而在使用一步法試劑測定標(biāo)本中含量可反常增高的物質(zhì)(例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等)時,應(yīng)留意可測規(guī)模的zui高值。用高親和力的單克隆抗體制備此類試劑可削弱鉤狀效應(yīng)。 雙抗體夾心法測抗原的另一留意點是類風(fēng)濕因子(RF)的攪擾。RF是一種本身抗體,多為IgM型,能和多種動物IgG的Fc段。用作雙抗體夾心法檢測的血清標(biāo)本中如含有RF,它可充任抗原成份,一起與固相抗體和酶標(biāo)抗體,表現(xiàn)出假陽性反響。雙抗體夾心法適用于測定二價或二價以上的大分子抗原,但不適用于測定半抗原及小分子單價抗原,因其不能構(gòu)成兩位點夾心。

雙抗體夾心法的扼要操作步驟為:
1)先參加抗體,使抗體固定于載體外表;
2)再加樣品,使方針檢測抗原構(gòu)成抗原-抗體復(fù)合物;
3)加酶標(biāo)抗抗體(第二種動物抗抗原的酶標(biāo)抗體);
4)參加酶促反響底物,發(fā)作顯色反響,顯色的深淺與待測抗原的量成正比。

競賽法檢測抗原

當(dāng)小分子抗原或半抗原因缺少可作夾心法的兩個以上的抗體位點,因而不能用雙抗體夾心法進(jìn)行測定,能夠選用競賽法形式。辦法的基本原理可見圖2,經(jīng)洗刷后分紅兩組:一組加酶符號抗原和被測抗原的混合液,而另一組只加酶符號抗原,再經(jīng)孵育洗刷后加底物顯色,這兩組底物降解量之差,即為所要測定的不知道抗原的量。小分子激素、藥物等ELISA測定多用此法。

競賽法的扼要操作步驟:
1)先參加抗體,使抗體固定于載體外表;
2)參加梯度濃度份額的待測樣品與酶標(biāo)抗原混合物,一起做只加酶標(biāo)抗原的對照組;
3)參加酶促反響底物,發(fā)作顯色反響,比照實驗組及對照組的顯色區(qū)別,核算不知道抗原的量。

雙抗原夾心法檢測抗體

雙抗原夾心法的反響形式與雙抗體夾心法相似。用特異性抗原進(jìn)行包被和制備酶物,以檢測相應(yīng)的抗體。與間接法測抗體的不一樣之處為以酶標(biāo)抗原代替酶標(biāo)抗抗體。此法中受檢標(biāo)本不需稀釋,可直接用于測定,因而其敏感度相對高于間接法。乙肝標(biāo)志物中抗HBs的檢測常選用本法。本法關(guān)鍵在于酶標(biāo)抗原的制備,應(yīng)根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)的不一樣,尋覓適宜的符號辦法。

雙抗原夾心法的扼要操作步驟為:
1)先參加抗原,使抗體固定于載體外表;
2)再加樣品,使方針檢測抗體構(gòu)成抗原-抗體復(fù)合物;
3)加酶標(biāo)抗原;
4)參加酶促反響底物,發(fā)作顯色反響,顯色的深淺與待測抗體的量成正比。

間接法檢測抗體

間接法是檢測抗體常用的辦法。其原理為利用酶符號的抗抗體(辣根過氧化物酶符號的兔抗*抗體)以檢測與固相抗原的受檢抗體(*),故稱為間接法。本法首要用于對病原體抗體的檢測而進(jìn)行流行癥的確診。間接法的長處是只需改換包被抗原就可利用同一酶標(biāo)抗抗體樹立檢測相應(yīng)抗體的辦法。

間接法的扼要操作步驟:
1)將特異性抗原與固相載體聯(lián)合,構(gòu)成固相抗原;
2)加稀釋的受檢血清,保溫反響。血清中的特異抗體與固相抗原,構(gòu)成固相抗原抗-體復(fù)合物;
3)加酶標(biāo)抗抗體;
4)參加酶促反響底物,發(fā)作顯色反響,顯色的深淺與待測抗體的量成正比。

競賽法檢測抗體

競賽法測抗體的反響形式與競賽法測抗原相似。用特異性抗原進(jìn)行包被和制備酶物,以檢測相應(yīng)的抗體。當(dāng)抗原材料中的攪擾物質(zhì)不易除掉,或不易得到滿足的純化抗原時,可用此法檢測特異性抗體。其原理為標(biāo)本中的抗體和一定量的酶標(biāo)抗體競賽與固相抗原。標(biāo)本中抗體量越多,在固相上的酶標(biāo)抗體愈少,因而陽性反響呈色淺于陰性反響。如抗原為高純度的,可直接包被固相。競賽法測抗體有多種形式,可將標(biāo)本和酶標(biāo)抗體與固相抗原競賽,抗HBc ELISA通常選用此法。另一種形式為將標(biāo)本與抗原一同參加到固相抗體中進(jìn)行競賽,洗刷后再參加酶標(biāo)抗體,與在固相上的抗原反響。抗HBe的檢測通常選用此法。

競賽法的扼要操作步驟:
1)先參加特異性抗原,使抗原固定于載體外表;
2)參加梯度濃度份額的待測樣品與酶標(biāo)抗體混合物,并做只加酶標(biāo)抗體的對照組;
3)參加酶促反響底物,發(fā)作顯色反響,比照實驗組及對照組的顯色區(qū)別,核算不知道抗體的量。

捕獲包被法檢測抗體

捕獲包被法(亦稱反向間接法)ELISA,首要用于血清中某種抗體亞型成分(如IgM)的測定。以現(xiàn)在zui常用的IgM測定為例,因血清中對于某種抗原的特異性IgM和IgG一起存在,則后者可攪擾IgM的測定。因而先將一切血清IgM(包含異性IgM和非特異性IgM)固定在固相上,在去掉IgG后再測定特異性IgM。IgM抗體的檢測用于流行癥的前期確診中。先用抗人IgM抗體包被固相,以捕獲血清標(biāo)本中的IgM(其間包含對于抗原的特異性IgM抗體和非特異性的IgM)。然后參加抗原,此抗原僅與特異性IgM相。繼而加酶符號對于抗原的特異性抗體。再與底物作用,呈色即與標(biāo)本中的IgM成正相關(guān)。此法常用于病毒性感染的前期確診。類風(fēng)濕因子(RF)相同能攪擾捕獲包被法測定IgM抗體,致使假陽性反響。因而中和IgG的間接法近期頗受喜愛,用這類試劑檢測抗CMV IgGM和抗弓形蟲IgM抗體已獲成功。

捕獲法測抗體的扼要操作步驟:
1)特異性捕獲抗體的包被,先把能特異性待測抗原的抗體固定于固相載體外表;
2)參加待測樣品,通過固定在載體外表的對于該抗原的抗體固定于載體外表;
3)參加特異性抗原以及對于該特異性抗原的酶標(biāo)抗體;
4)參加酶促反響底物,發(fā)作顯色反響,顯色的深淺與待測抗體的量成正比。

ABS-ELISA法

除以上6種ELISA測試辦法外,近年在親和素-*體系上又發(fā)展出ABS-ELISA法 。親和素是一種糖蛋白,每個分子由4個能和*的亞基構(gòu)成,*為小分子化合物。用化學(xué)辦法制成的衍*-羥基琥珀酰亞胺酯可與抗體或酶構(gòu)成*符號產(chǎn)品,符號辦法較為簡潔,并且不影響抗體或酶原有的生物學(xué)活性。親和素*體系,簡稱ABS(avidin-biotin system)。由于親和素與*間的親和力*,敏捷,且極其安穩(wěn),使BAS符號技能比常規(guī)酶聯(lián)免疫、放射免疫及熒光免疫技能有著更高的靈敏度,為微量抗原、抗體的檢測開辟了新的路徑,大大提高了檢測的靈敏度,但該辦法比一般ELISA多用了兩種試劑,增加了操作步驟,因而在臨床檢驗中ABS-ELISA使用不多。ABS-ELISA法可分為酶符號親和素-*(LAB)法和橋聯(lián)親和素-*(ABC)法兩種類型。兩者均以*符號的抗體(或抗原)代替原ELISA體系中的酶標(biāo)抗體(抗原)。

在LAB法中,將特異性抗體*化、酶分子符號在親和素分子上,*化抗體與被檢抗原后,再借BAS的高度親和力將酶分子聯(lián)合到抗原分子上,經(jīng)酶促反響即可檢出抗原,因而提高檢測的敏感度。

ABC法相同將特異性抗體*化、酶分子標(biāo)在*上,親和素和酶標(biāo)*需求先按一定份額構(gòu)成ABC復(fù)合物,這種網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)了很多的酶分子,當(dāng)親和素尚未被酶標(biāo)*飽滿時,*化抗體即可與之, 使被檢抗原、*化抗體和酶標(biāo)*聯(lián)成一體。


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