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ELISA試劑盒試劑制造研討辦法

閱讀:142發(fā)布時(shí)間:2017-11-13

完整的ELISA試劑盒包括以下各組分:已包被抗原或抗體的固相載體(免疫吸附劑);酶標(biāo)記的抗原或抗體(結(jié)合物);ELISA試劑盒酶的底物;陰性對照品和陽性對照品(定性測定中),參閱標(biāo)準(zhǔn)品和操控血清(定量測定中);酶聯(lián)物(結(jié)合物)及標(biāo)本的稀釋液;洗刷液;酶反響終止液。ELISA中有三個(gè)必要的試劑:免疫吸附劑、結(jié)合物和酶的底物等。
ELISA試劑盒疫吸附劑已包被抗原或抗體的固相載體在低溫(2~8℃)枯燥的前提下一般可保存6個(gè)月以上。可作ELISA中載體的資料良多,zui常用的是聚苯乙烯。ELISA試劑盒以含鐵的磁性微粒作為ELISA固相載體,反響后用磁鐵的吸引進(jìn)行分離,洗刷利便,ELISA試劑盒一般均配以特別儀器。為比較不同固相在某一ELISA測定中的好壞,可應(yīng)用如下的實(shí)驗(yàn):用其他免疫學(xué)測定辦法選出一個(gè)典型的陽性標(biāo)本和陰性標(biāo)本,將它們進(jìn)行一系列稀釋后,在不同的固相載體上按預(yù)訂的ELISA操縱進(jìn)程進(jìn)行測定,然后比較成果。小試管還能夠當(dāng)作比色杯,ELISA試劑盒zui終直接放入分光光度計(jì)中比色。直接包被的抗原經(jīng)固相抗體的親和層析作用,包被在固相上的抗原純度大大前進(jìn),因而含雜質(zhì)較多的抗原也可選用捕捉包被法,實(shí)驗(yàn)的特異性、敏感性均由此得以改進(jìn),重復(fù)性亦佳。聚苯乙烯具有較強(qiáng)的吸附蛋白質(zhì)的機(jī)能,抗體或蛋白質(zhì)抗原吸附其上后仍留存本來的免疫學(xué)活性,加之它的價(jià)格低廉,所以被遍及選用。蛋白質(zhì)與聚苯乙烯固相載體是經(jīng)過物理吸附結(jié)合的,靠的是蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)上的疏水基團(tuán)與固相載體外表的疏水基團(tuán)間的作用力。操控反響前提,使各孔讀數(shù)在吸光度0.8左右。一切單個(gè)讀數(shù)與悉數(shù)讀數(shù)的均數(shù)之差,應(yīng)小于10%。例如,在檢測抗DNA抗體時(shí),需用DNA作為包被抗原,而遍及的固相載體一般不能直接與核酸結(jié)合。ELISA板的特色是能夠一起進(jìn)行大量標(biāo)本的檢測,并可在特制的比色計(jì)上迅速讀出成果。換言之,包被等于抗原或抗體結(jié)合到固相載體外表的進(jìn)程。在哪一種載體上陽性成果與陰性成果差別zui大,這種載體就是這一ELISA測定項(xiàng)目的zui合適的固相載體。
ELISA載體的外形主要有三種:微量滴定板、小珠和小試管。杰出的ELISA板應(yīng)該是吸附機(jī)能好,空缺值低,孔底透明度高,ELISA試劑盒各板之間、統(tǒng)一板各孔之間、統(tǒng)一板各孔之間機(jī)能相近。再者,球型小珠的外表弧度更有利于吸附的抗原決定簇或抗體結(jié)合位點(diǎn)的暴出面處于反響狀況,因而珠式ELISA的反響往往更為靈敏。IgG對聚苯乙烯等固相具有較強(qiáng)的吸附力,其聯(lián)結(jié)多發(fā)生在Fc段上,抗體結(jié)合點(diǎn)露出于外,因而抗體的包被一般均選用直接吸附法。 
ELISA試劑盒小試管作為固相載體也有較大的吸附外表,并且標(biāo)本的反響量也相應(yīng)添加。在ELISA中,用作固相載體的小珠一般為直徑0.6cm的圓珠,外表經(jīng)磨砂處理后吸附面積大大添加。當(dāng)抗原決定簇存在于或臨近于疏水區(qū)域時(shí),抗原與固相載體的直接吸附可使抗原決定簇不能充沛露出,在這種情況下,直接包被作用欠安,能夠選用直接的捕捉包被法,ELISA試劑盒即先將針對該抗原的特異抗體作預(yù)包被,這以后經(jīng)過抗原抗體反響使抗原固相化。ELISA試劑盒聚氯乙烯對蛋白質(zhì)的吸附機(jī)能比聚苯乙烯高,但空缺值也略高。固相載體先用堿性蛋白質(zhì),如聚賴氨酸、*等作預(yù)包被,也可前進(jìn)核酸的結(jié)協(xié)力。作為ELISA固相載體,聚氯乙烯的特色為質(zhì)軟板薄,可剪割,價(jià)廉,但光潔度不如聚苯乙烯板,孔底亦不如聚苯乙烯平坦。

 


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