分子熒光分光光度計的熒光強度容易受外界因素的影響，如樣品池、激發光源、溫度、溶液的pH值、溶劑性質、其它溶質、表面活性劑等都會造成熒光強度的變化。嚴格控制測試條件對熒光分析來說至關重要。
1.樣品應盛在四面透光的石英比色皿（熒光池）中，如果是揮發性樣品應使用帶塞的熒光池。
2.熒光分析時，為了得到穩定可靠的數據，一般需要開機預熱氙燈大約30min。如果儀器光源采用的是閃爍氙燈，預熱時間可以縮短到10min左右。對某些易感光、易分解的熒光物質，盡量采用長波長、低人射光強度及短時間光照。
3.溫度變化可引起熒光強度的改變。通常降低溫度，有利于提高熒光量子產率，熒光強度增大。溫度影響熒光強度的顯著程度因樣品而異，大部分熒光物質的熒光強度受溫度影響不大，測試溫度變化不超過±3℃，對測試結果幾乎無影響。
4.當熒光物質是弱酸或弱堿時，溶液的pH對熒光強度有較大影響。因為弱酸或弱堿在不同酸度中，分子和離子的電離平衡會發生改變，而熒光物質的熒光強度會因其離解狀態發生改變。
5.分子結構中存在π-π共軛的熒光物質在極性溶劑中，熒光效率顯著增強。溶液中表面活性劑的加入能夠顯著提高熒光強度。
6.瑞利散射和拉曼散射是溶劑的兩種散射光，應注意不要誤把瑞利散射和拉曼散射光譜當做熒光光譜。瑞利散射光波長與激發光波長相同，拉曼散射與激發光波長不同，而熒光物質的熒光波長與激發光波長無關，因此可以通過選擇適當的激發波長將拉曼散射光與熒光分開。在測試時選擇合適的狹縫寬度，或者空白扣除，也可以對散射光的影響進行校正。
7.熒光物質分子與溶液中其它物質分子之間作用導致熒光強度降低，常見的熒光猝滅劑，如鹵素離子、重金屬離子、硝基化物質、重氮化合物等。溶液中的溶解氧也能引起幾乎所有的熒光物質產生不同程度的熒光熄滅現象，因此，在較嚴格的熒光實驗中必須除02。
8.測試過程中注意不要肉眼盯著氙燈光源看，以防對眼睛造成損傷。
9.分子熒光分光光度計工作室內應注意經常通風，避免產生的臭氧在室內富集。
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