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滲入法測定細胞周期的原理與操作步驟

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一、原理

細胞周期指細胞一個世代所經歷的時間。從一次細胞分裂結束到下一次分裂結束為一個周期。細胞周期反應了細胞增殖速度。

單個細胞的周期測定可采用縮時攝影的方法,但它不能代表細胞群體的周期,故現多采用其他方法測群體周期。

測定細胞周期的方法很多,有同位素標記法、細胞計數法等,這里介紹一種利用BrdU滲入測定細胞周期的方法。

BrdU(5-溴脫氧*核苷)加入培養基后,可做為細胞DNA復制的原料,經過兩個細胞周期后,細胞中兩條單鏈均含BrdU的DNA將占l/2,反映在染色體上應表現為一條單體淺染。如經歷了三個周期,則染色體中約一半為兩條單體均淺染,另一半為一深一淺。細胞如果僅經歷了一個周期,則兩條單體均深染。計分裂相中各期比例,就可算出細胞周期的值。

二、儀器、用品與試劑

1、儀器、用品:同常規細胞培養

2、試劑:BrdU(1.0mg/ml),甲醇、冰醋酸,Giemsa染液,秋水仙素,2×SSC液

三、操作步驟

1、細胞生長至指數期時,向培養液中加入BrdU,使zui終濃度為10μg/ml。

2、44小時加秋水仙素,使每ml中含0.1μg。

3、48小時后常規消化細胞至離心管中,注意培養上清的漂浮細胞也要收集到離心管中。

4、常規染色體制片(見第三部分:染色體技術)。

5、染色體玻片置56℃水浴鍋蓋上,鋪上2×SSC 液,距紫外燈管6cm處紫外照射30分鐘。

6、棄去2×SSC液,流水沖洗。

7、Giemsa液染色10分鐘,流水沖洗,晾干。

8、鏡檢100個分裂相,計*、二、三、四細胞期分裂指數。

9、計算:

細胞周期(Tc)=48/{(M1+2M2+3M3+4M4)/100}(小時)

附:(1)BrdU配制: BrdU 10mg十雙蒸水10ml 4℃下避光保存。

(2)2×SSC配制: NaCl 1.75克,檸檬酸三鈉•2H2O 0.88克,加水至100ml,4℃保存。

注意事項:BrdU溶液需要避光保存在 4℃冰箱,SSC溶液也需要4℃保存,可根據實驗需要分裝后高壓滅菌。

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