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上海莼試生物技術(shù)有限公司
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分析干細胞復蘇后貼壁細胞較少的問題

時間:2017-9-29閱讀:3114
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疑問:以前拿回干細胞后,傳代、凍存后復蘇過幾次都沒什么問題,zui近因?qū)嶒炇曳跸湮廴荆鍧嵪炯毎液螅匦聫吞K,結(jié)果連續(xù)復蘇6支,細胞均未貼壁,今晚復蘇6小時后觀察有一瓶相對貼壁細胞數(shù)較之前復蘇失敗瓶多,但貼壁細胞狀態(tài)不好,形態(tài)不佳,透光度亦不好!急求各位大俠會診指導!

分析1:復蘇過程沒有問題,是否是從液氮拿出直接放入溫水,還有培養(yǎng)箱,二氧化碳濃度,培養(yǎng)基、PH值等環(huán)節(jié)。要么加高濃度FBS 15-20%,看看能否幫助貼壁,當然也需要考慮血清問題,還有確信拿來的細胞沒問題。

分析2:首先應該懷疑凍存,實際上復蘇出問題的可能非常小,因為操作簡單,而且死板。

1、你凍存的時候是不是消化的時間過長,這是一般人所注意不到的,即使書上也不講這個問題,但我因為這個問題就兩種肺癌細胞和一種肝癌細胞專門做過試驗,這個是絕大部分人細胞復不活的一個原因。太長的消化時間會讓細胞復蘇時失去貼壁能力,表現(xiàn)為先貼后死,原因是在你復蘇的時候細胞已進入凋亡程序,不可逆轉(zhuǎn)的死亡。

2、你的凍存液好不好,是什么,甘油還是DMSO,質(zhì)量非常重要,否則也會死亡。

3、你的凍存液的量加的是不是太多,ATCC*是不超過7%,大于5%,太多也不好。

4、你在凍存的時候是不是把DMSO混均勻,這個有一些影響,但不算太大。

5、你的凍存是否按部就班,就是所溫度梯度是不是把握嚴格,很多人容易忘卻這個事情,因為這個東西流程長。

6、如果你細胞污染,你是否能很快看到,我比我的導師能早一天看到污染。從這個角度講建議去除離心這步。

7、你的細胞在凍存前是否過密。

還有,不贊成孵箱污染這個概念的,所有在一個孵箱里的細胞都污染一個細菌的話,這個細菌是源于孵箱的,但這不代表孵箱污染,因為孵箱無論你如何處理都有大量的細菌,問題在操作。我們的細胞房不換拖鞋,非常臟,別人的細胞都污染,很多細胞都污染到絕種,但我的只污染一次(兩年內(nèi)只有兩瓶),那次是因為別人給我動了,我每次干細胞擺放順序都是記住的。如果你老懷疑孵箱污染,那說明你在養(yǎng)細胞這方面很差。

每次污染的原因都要盡可能的找,以后就不犯同樣的問題,這個很重要,不能靠猜,否則你就有可能細胞養(yǎng)絕zui后換課題,這個見得太多了,別不當會事。
進口/國產(chǎn)        *    5克
*    保存:-20℃    無水*    5克
*        *    25克
*        磷酸三鈉    100克
進口/國產(chǎn)        2,2’-聯(lián)喹啉-4,4’-二羧酸鈉    1公斤
*        D(-)酒石酸鈉    5克
*        L(-)酒石酸鈉    25克
*        偏釩酸鈉    0.25毫升
進口/國產(chǎn)    RT    無水偏釩酸鈉    5克
*        四苯硼鈉    25克
*        氟化鈉    100克
*        氫氧化鈉    500克
進口/國產(chǎn)    RT    草酸鈉    1克
*        硫化鈉    25克
干細胞

 

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