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蝦白尾?。╓TD)RT-PCR 檢測(cè)試劑盒(MrNV)說(shuō)明書(shū)

時(shí)間:2018-1-18閱讀:103
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1、蝦白尾病(WTD)RT-PCR 檢測(cè)試劑盒(MrNV)簡(jiǎn)介 
貨號(hào):HB-810-3 
蝦白尾?。╓hite tail disease,WTD)也稱(chēng)為白肌肉?。╓hite muscle disease,WMD)或羅
氏沼蝦肌肉白濁病(Macrobrachium rosenbergii Whitish muscle disease),主要在亞洲和南美洲
北部流行。其主要病原為羅氏沼蝦野田村病毒(Macrobrachium rosenbergii Nodavirus,MrNV),
研究發(fā)現(xiàn)感染對(duì)蝦中還存在另外一種超小型病毒(Extra small virus,XSV),為 MrNV 的微型病毒。
蝦感染后腹部、尾部出現(xiàn)白色渾濁,Z終可擴(kuò)散全身肌肉,死亡率可達(dá) 95%以上。
為了適應(yīng)蝦白尾病快速檢測(cè)和疫病研究的需要,本公司參考國(guó)家質(zhì)檢總局發(fā)布的《白尾病檢疫
技術(shù)規(guī)范》(SN/T 3583-2013)中*的的引物和探針序列,經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)及系統(tǒng)優(yōu)化,開(kāi)發(fā)生產(chǎn)了
本試劑盒。應(yīng)用本試劑盒進(jìn)行檢測(cè)具有快速、靈敏、特異、準(zhǔn)確、安全操作簡(jiǎn)單、應(yīng)用廣泛和高通
量檢測(cè)等特點(diǎn)及優(yōu)點(diǎn)。
2、 試劑盒組成 
試劑盒組成包括核酸擴(kuò)增試劑。具體組成參見(jiàn)表 1:
表 1:試劑盒組成(50test/盒)
試劑盒組成成分 體積 
*: 核酸裂解液 15ml×2 管
核酸擴(kuò)增試劑: DEPC 水
WTD-MrNV RT-PCR 反應(yīng)液
酶混合物
陰性對(duì)照
WTD-MrNV 陽(yáng)性對(duì)照
1ml×1 管
750µL×1 管
60µL×1 管
1ml×1 管
1ml×1 管
(注:*可使用本公司生產(chǎn)的提取核酸更快捷方便的《病毒 RNA 柱式提取試劑盒》) 
3、 樣本采集,存放及運(yùn)輸 
3.1 樣本采集:所用取樣器材必須經(jīng)高壓滅菌并烘干。隨機(jī)取5只-10只新鮮的蝦作為采樣標(biāo)本,采
集的部位包括:蝦頭部的鰓絲、肝胰腺、淋巴器官或血淋巴等組織(可部分或全部采集這些組織)。
對(duì)于仔蝦或稚蝦,取整只蝦或蝦頭作為樣品;蝦糞便直接勻漿待檢。詳見(jiàn)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。
3.2 存放:研磨后的樣本在 2 ℃—8 ℃條件下保存應(yīng)不超過(guò) 24 h;-70 ℃以下可*保存,但應(yīng)避
免反復(fù)凍融(Z多凍融 3 次)。
3.3 運(yùn)輸:采用泡沫箱加冰密封進(jìn)行運(yùn)輸。
4、 RT-PCR 檢測(cè) 
4.1 RNA 核酸提取操作方法 
4.1.1 取 n 個(gè)滅菌的 1.5 mL Eppendorf 管,其中 n 為被檢樣品與陰性對(duì)照的和(陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照在試劑盒中已標(biāo)出),做標(biāo)記。(注:試劑盒中的陽(yáng)性對(duì)照直接作為 PCR 檢測(cè)的模板,無(wú)需提
取核酸)
4.1.2 每管加入 600 ?L 裂解液,分別加入被檢樣本和陰性對(duì)照各 200 ?L,一份樣本換用一個(gè)吸頭,混勻器上振蕩混勻 5 s(不能過(guò)于強(qiáng)烈,以免產(chǎn)生乳化層,也可以用手顛
倒混勻),于 4℃ 12 000 r/min 離心 15 min。
4.1.3 蝦白尾?。╓TD)RT-PCR 檢測(cè)試劑盒(MrNV)取與 4.1.1.1 相同數(shù)量滅菌的 1.5 mL Eppendorf 管,加入 500 ?L 異丙醇(-20℃預(yù)冷),做標(biāo)記。吸取 4.1.1.2 各管中的上清液轉(zhuǎn)移至相應(yīng)的管中,上清液應(yīng)至少吸取 500?L,不能吸出
中間層,顛倒混勻。
4.1.4 于 4 ℃、12 000 r/min 離心 15 min(Eppendorf 管開(kāi)口保持朝離心機(jī)轉(zhuǎn)軸方向放置),小心
倒去上清,倒置于吸水紙上,沾干液體(不同樣品須在吸水紙不同地方沾干);加入 600 ?L 75%
乙醇,顛倒洗滌。
4.1.5 于 4 ℃、12 000 r/min 離心 10 min(Eppendorf 管開(kāi)口保持朝離心機(jī)轉(zhuǎn)軸方向放置),小心
倒去上清,倒置于吸水紙上,盡量沾干液體(不同樣品須在吸水紙不同地方沾干)。
4.1.6 4 000 r/min 離心 10s(Eppendorf 管開(kāi)口保持朝離心機(jī)轉(zhuǎn)軸方向放置),將管壁上的殘余液
體甩到管底部,小心倒去上清,用微量加樣器將其吸干,一份樣本換用一個(gè)吸頭,吸頭不要碰到有
沉淀一面,室溫干燥 3 min,不能過(guò)于干燥,以免 RNA 不溶。
4.1.7 加入 11 ?L DEPC 水,輕輕混勻,溶解管壁上的 RNA,2 000 r/min 離心 5 s,冰上保存?zhèn)溆谩?br />提取的 RNA 須在 2 h 內(nèi)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增;若需*保存須放置-70 ℃冰箱內(nèi)。
【也可參照《病毒 RNA 柱式提取試劑盒說(shuō)明書(shū)》(貨號(hào):HB-QPCR-01)使用,更方便快捷提取
核酸】。
注:提取的 RNA 須在 2 h 內(nèi)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增;若需*保存須放置-70 ℃冰箱內(nèi)。 
4.2 RT-PCR 檢測(cè) 
4.2.1 擴(kuò)增試劑準(zhǔn)備(在反應(yīng)混合物配制區(qū)進(jìn)行):
從試劑盒中取出相應(yīng)的 RT-PCR 反應(yīng)液、酶混合物,在室溫下融化后,2000 r/min 離心 5 s。每
個(gè)樣品測(cè)試反應(yīng)體系配制見(jiàn)表 2:
表 2 每個(gè)樣品測(cè)試反應(yīng)體系配制表
試劑 RT-PCR 反應(yīng)液 酶混合物
用量 15 μL 1.0 μL
4.2.2 加樣(樣本處理區(qū)進(jìn)行):
向每個(gè)PCR管空中各分裝15ul的混合液,再分別加入上述樣本處理步驟4.1.7中制備的RNA溶液各
10 ?L,蓋緊管蓋,500 r/min離心30 s。
4.2.3 RT-PCR 檢測(cè)(在檢測(cè)區(qū)進(jìn)行):
*階段:42 o
C /30 min;
第二階段:95oC /2 min;
第三階段:94 oC /40 sec, 55 oC /40 sec,72 oC /1 min,35個(gè)循環(huán);
第四階段:72 oC /10 min; 
第五階段:4 oC 保存
4.3 瓊脂糖電泳 
用電泳緩沖液制備 1.5%的瓊脂糖凝膠平板。將平板放入水平電泳槽,使電泳緩沖液剛好沒(méi)過(guò)膠
面,向 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物中加入 1/6 體積的電泳上樣緩沖液(6X 上樣緩沖液),按比例混勻后加入樣品孔。在電泳時(shí)設(shè)立 DNA DL2000 Marker 做對(duì)照。5 V/cm 電泳約 0.5h,當(dāng)溴酚藍(lán)到達(dá)一定位置時(shí)停止。
在紫外燈下或凝膠成像儀的紫外透射光下觀察是否擴(kuò)增出預(yù)期的特異性 DNA 電泳帶,拍攝并記錄。
5、結(jié)果判定 
5.1 RT-PCR 后,陽(yáng)性對(duì)照會(huì)出現(xiàn)一條 425 bp 的 DNA 片段。陰性對(duì)照和空白對(duì)照沒(méi)有該核酸帶。
5.2 蝦白尾?。╓TD)RT-PCR 檢測(cè)試劑盒(MrNV)待測(cè)樣品 PCR 擴(kuò)增后能在相應(yīng) 425 bp DNA 位置上有帶,可判為 MrNV 核酸陽(yáng)性。 

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