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由以上方法可知，在色譜法中存在兩相，一相是固定不動的，我們把它叫做固定相；另一相則不斷流過固定相，我們把它叫做流動相。

色譜法的分離原理就是利用待分離的各種物質在兩相中的分配系數、吸附能力等親和能力的不同來進行分離的。

使用外力使含有樣品的流動相（氣體、液體）通過一固定于柱中或平板上、與流動相互不相溶的固定相表面。當流動相中攜帶的混合物流經固定相時，混合物中的各組分與固定相發生相互作用。

由于混合物中各組分在性質和結構上的差異，與固定相之間產生的作用力的大小、強弱不同，隨著流動相的移動，混合物在兩相間經過反復多次的分配平衡，使得各組分被固定相保留的時間不同，從而按一定次序由固定相中先后流出。與適當的柱后檢測方法結合，實現混合物中各組分的分離與檢測。