當(dāng)前位置:上海撫生實業(yè)有限公司>>技術(shù)文章>>RNA pulldown步驟方法
RNA結(jié)合蛋白(RBPs)在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因的表達起著重要的作用,具體的作用包括mRNA前體的剪接、多腺苷化和穩(wěn)定性的維持,mRNA從細胞核向細胞質(zhì)的運輸,mRNA的定位和翻譯等。RBPs在這些過程中的調(diào)節(jié)作用是通過結(jié)合新合成的或者成熟后的轉(zhuǎn)錄物的特定序列實現(xiàn)的。于此同時,有很多RBPs能夠識別RNA中的特定核苷酸序列。
RNA pulldown方法,其特征在于,包含以下步驟:S1、磁珠預(yù)處理:使用BSA和寡核苷酸隨機引物封閉鏈霉親和素標(biāo)記的磁珠;S2、制備探針?磁珠復(fù)合物:將步驟S1預(yù)處理的磁珠與*標(biāo)記的RNA探針結(jié)合;S3、提取并預(yù)處理細胞全蛋白:向提取的細胞全蛋白中加入脫氧核糖核酸酶孵育,再加入未預(yù)處理的磁珠孵育,去除磁珠,收集上清;S4、pulldown:將步驟S3收集的上清加入到步驟S2制備的探針?磁珠復(fù)合物中,加入脫氧核糖核酸酶抑制劑和核糖核酸酶抑制劑孵育,收集磁珠,用含核糖核酸酶抑制劑的NT2 buffer洗滌磁珠,得到蛋白?探針?磁珠復(fù)合物;S5、RNP的收集:將步驟S4制得的蛋白?探針?磁珠復(fù)合物加入Urea CHAPS buffer孵育,去除磁珠,收集上清即得RNP。
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