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原位雜交-典型實驗方案背景

來源:培安有限公司   2022年08月05日 17:04  

原位雜交1.jpg


復水(有時候也用到脫水,只是順序相反)

溫度:環境

描述:通過一系列的緩沖液交換將樣品從在100% 甲醇或乙醇的儲存條件中轉移到水緩沖液中。通常從100%的乙醇交換到75%、50%、25%、0%,每次交換后留5 min進行平衡即可。如脫水進行太快或不進行脫水,樣品形態將被破壞,甚至被撕成碎片。

漂白(可選

溫度:環境

描述:通常與3%的過氧化氫孵育,以擺脫內部的過氧化物酶和漂白暗色的胚胎

 

烷基化(可選,INTAVIS儀器不能完成)

溫度:環境

描述:三乙醇胺中的乙酸酐用于使組織帶負電荷,從而降低背景。它被廣泛應用,特別是在植物領域,用極少的探針就可以增強結果。

自動化時:乙酸酐在溶液中非常不穩定,它在制備后能用于孵育的時間不超過一分鐘,因此不可能實現自動化(并且探針通常不需要)。

原位雜交3.jpg


細胞壁消化(可選,只在植物中)

溫度:環境

描述:植物樣品中主要使用鹽酸水解細胞壁。或者如崩潰酶和纖維素酶等酶類也能被使用。

 

滲透(時間要求嚴格)

溫度:環境或37℃

描述:使探針能接觸樣品組織至關重要。這步處理通常使用蛋白酶,主要是蛋白酶K,但鏈霉蛋白mei和其他蛋白酶也能被使用。但也有其他的處理方法,如熱處理(蒸汽)或與洗滌劑混合物孵育。對于蛋白酶K,甘氨suan通常被用來立即停止蛋白酶K的作用,或者通過數次換液將蛋白酶K 洗掉。滲透后,通常會使用多聚甲醛進行固定。

自動化時:所有蛋白酶應足夠穩定,到使用前不會自我分解,如蛋白酶K。

 

雜交

溫度:通常50-70℃(RNAse 在37℃)

描述:雜交由幾步組成:

1,預雜交步驟(可選)逐步交換雜交 緩沖液,并封閉非特異結合位點

2,雜交步驟,與探針孵育

3,雜交后洗滌步驟,用越來越嚴格的緩沖液進行多次洗滌

4,通常在雜交后洗脫步驟之間,進行RNAse消化(可選)來擺脫未結合的探針減少背景:RNAse緩沖液洗滌,用RNAse處理,再次RNAse緩沖液洗滌,所有步驟在37℃進行。

5,更多的雜交后洗滌

原位雜交2.png


抗體孵育

溫度:環境或更低

描述

在此步驟中,抗體與探針上的抗原結合

1. 用封閉試劑封閉(如Roche 封閉試劑,BSA,山羊或綿羊血清)。在這一步,所有非特異抗體結合位點將被蛋白飽和

2, 與抗體孵育,讓抗體抗原結合

3, 洗滌步驟,洗滌未結合抗體

自動化時:由于基本上所有檢測探針的抗體都是商業化的,它們室溫下工作并具有相同的特異性。抗體結合在室溫下更快結合。

 

與堿性磷酸酶緩沖液孵育(如NTMT

溫度:環境

描述:與新鮮制備的緩沖液孵育,為堿性磷酸酶顏色反應做準備

自動化時:使用堿性磷酸酶偶聯抗體時,緩沖液儲存過久或使用前制備時會沉淀。

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