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EMSA助力揭示楊樹扦插生根中LBD16介導(dǎo)通路的保守性

來源:藍(lán)景科信河北生物科技有限公司   2024年05月17日 11:44  

2023年6月15日,北京林業(yè)大學(xué)林金星研究組、李曉娟研究組,中國科學(xué)院徐麟研究組聯(lián)合在The Innovation Life期刊上在線發(fā)表了題為“Transcriptome framework of root regeneration reveals the conservation of the LBD16-mediated pathway in poplar cuttings”的文章,揭示了楊樹扦插中不定根再生的轉(zhuǎn)錄組圖譜,并通過EMSA等一系列實(shí)驗(yàn)證明了LBD16在促進(jìn)不定根再生方面的保守作用。

扦插再生不定根是一種非常實(shí)用的樹木無性繁殖方法。楊樹是生長快、生物量大的重要樹種,廣泛應(yīng)用了枝條扦插再生不定根技術(shù)。為解楊樹扦插中不定根再生的機(jī)制,作者對84K楊(Populus alba × Populus glandulosa)的莖損傷區(qū)域進(jìn)行了時序RNA測序(RNA-seq),基因集富集分析(GSEA)顯示,在不定根再生過程中,光合作用相關(guān)基因表達(dá)下調(diào),損傷和氧化應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)基因、乙烯激活信號通路和脫落酸激活信號通路相關(guān)基因均快速上調(diào),這些信號通路可能參與了損傷后莖的保護(hù)作用。與硝酸鹽跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性和鉀離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性相關(guān)的基因也迅速上調(diào),內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與細(xì)胞質(zhì)生長素運(yùn)輸相關(guān)基因表達(dá)上調(diào),與根、分生組織發(fā)育和分生組織維持相關(guān)的基因也在扦插損傷部位上調(diào)。通過分析不定根器官形成過程中與細(xì)胞命運(yùn)轉(zhuǎn)變有關(guān)的關(guān)鍵基因,發(fā)現(xiàn)PagWOX11.1a/b和PagLBD16.2a/2b/3a表達(dá)上調(diào),qRT-PCR分析證實(shí)了PagWOX11.1a/b和PagLBD16.3a/b在莖切割后的表達(dá)模式。

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)許多擬南芥同源基因,在根頂端分生組織或側(cè)根器官形成中發(fā)揮干細(xì)胞生態(tài)位活性和細(xì)胞分化功能。此外,生長素信號通路、生長素運(yùn)輸和生長素生物合成相關(guān)基因在根再生過程中均表達(dá)上調(diào)。這表明,在不同物種的扦插過程中,與根系再生有關(guān)的基因網(wǎng)絡(luò)可能是相似的。

隨后作者重點(diǎn)研究了LBD16在楊樹不定根再生中的作用,對LBD基因進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析,結(jié)果顯示在楊柳屬中存在兩個AtLBD16同源基因分支,即LBD16.2分支和LBD16.3分支,均位于IIIA亞類。雜交84K楊基因組包含4個LBD16基因,毛果楊(Populus trichocarpa)基因組包含兩個LBD16基因,過表達(dá)PtrLBD16.3 (35Spro:PtrLBD16.3)顯著增強(qiáng)了84K楊的不定根再生,這表明LBD16蛋白在促進(jìn)不定根再生過程中可能具有進(jìn)化保守性。

楊樹屬植物LBD16.2LBD16.3基因的啟動子區(qū)存在許多保守區(qū)域,包括生長素反應(yīng)元件(AuxREs)和WOX結(jié)合的順式作用元件(WOXCEs)。 qRT-PCR分析結(jié)果顯示,用合成生長素1-萘乙酸(NAA)處理斷枝損傷區(qū)域,PagLBD16.3a/b表達(dá)上調(diào),在84K楊中過表達(dá)PagWOX11.1a35Spro:PagWOX11.1a )基因,PagLBD16.3a/b也表達(dá)上調(diào)。染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)和電泳遷移(EMSA)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了PagWOX11.1a蛋白可能與PagLBD16.3a啟動子區(qū)的一個WOXCE結(jié)合。這些結(jié)果表明,在楊樹再生不定根過程中,生長素和WOX11可能上調(diào)LBD16的表達(dá),這與擬南芥中WOX11-LBD16的分子途徑類似。

EMSA實(shí)驗(yàn)中探針序列為:5'-CATATTTGCATAAACCCATTAATAAATGTTCCCTGAA-3',分別設(shè)置了不同濃度的冷探針與探針進(jìn)行競爭,冷探針量越多,結(jié)合條帶越淺,這說明蛋白和探針有結(jié)合作用。

綜上所述,本研究以及其他楊樹WOX11和擬南芥的研究結(jié)果表明,生長素、WOX11LBD16促進(jìn)扦插不定根再生的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)可能具有進(jìn)化保守性。因此,LBD16有望作為提升不同物種扦插生根效率的分子工具。

EMSA.png

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