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實時熒光定量PCR技術實驗操作步驟

來源:上海邦景實業有限公司   2025年04月27日 13:16  

實時熒光定量PCR技術實驗操作步驟:

1、RNA提取:

  針對莖環狀結構RT引物,RNA正常提取就好;對于Oligod(T)特異的RT引物,盡量用特殊試劑盒提取miRNA。

2、反轉錄:

  反轉錄過程對酶沒有特殊要求,操作按照反轉錄酶的說明書進行。對于引物,在反轉錄過程中只需加入Oligod(T)特異的RT引物或莖環狀結構RT引物,不需要另外添加其他RT引物。用Oligod(T)特異的RT引物時,RNA需要進行3'Poly(A)加尾處理。

  內參基因不需要單獨設計RT引物,可以用熒光定量PCR的反向引物作為RT引物。

3、熒光定量PCR:

  先優化PCR體系(引物濃度、退火溫度等),進行引物測試,確保擴增曲線正常且溶解曲線為單一的尖峰,陰性對照無擴增,則引物測試合格,再進行后續實驗(常規操作)。

   




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