【儀表網(wǎng) 儀表標(biāo)準(zhǔn)】《低溫乳制品中金黃色葡萄球菌檢驗(yàn) 實(shí)時(shí)熒光PCR方法》團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)已完成征求意見(jiàn)稿的編制，根據(jù)《團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)管理規(guī)定》的要求，為保證標(biāo)準(zhǔn)的科學(xué)性、嚴(yán)謹(jǐn)性和可操作性，現(xiàn)在《全國(guó)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)信息平臺(tái)》面向社會(huì)各界公開(kāi)征求意見(jiàn)。
 

　　本文件按照GB/T 1.1的編寫(xiě)規(guī)則起草。參考GB 4789.1 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物檢驗(yàn)總則；GB 4789.10 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)；GB 4789.28 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求；GB 19489 實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求；GB/T 27403 實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品分子生物學(xué)檢驗(yàn)等規(guī)程編制。
 

　　本文件規(guī)定了巴氏殺菌乳、高溫殺菌乳(低溫保存)、發(fā)酵乳、調(diào)制乳等低溫乳制品中金黃色葡萄 球菌的實(shí)時(shí)熒光 PCR 檢測(cè)法(商品化試劑盒方法)。本文件適用于巴氏殺菌乳、高溫殺菌乳(低溫保存)、發(fā)酵乳、調(diào)制乳等低溫乳制品中金黃色葡萄 球菌的快速初篩及鑒定。
 

　　儀器和設(shè)備：
 

　　除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備如下: 恒溫培養(yǎng)箱:36 ℃±1 ℃；電子天平:感量 0.1 g；均質(zhì)器(旋刀或拍擊式)或等效設(shè)備；pH 計(jì)或精密 pH 試紙:精密度 0.1；微量移液器及無(wú)菌帶濾芯吸頭；金屬浴:98 ℃ ± 1 ℃；掌式離心機(jī)；實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 儀；低溫冰箱。
 

　　樣品制備及增菌培養(yǎng)：
 

　　將樣品平衡至室溫，無(wú)菌操作稱取25 g(mL)樣品，置于盛有225 mL 7.5%氯化鈉肉湯的無(wú)菌均質(zhì) 袋或其他無(wú)菌容器中，若樣品是固態(tài)或半固態(tài)，用拍擊式均質(zhì)器拍打1 min ~2 min混勻(或用旋轉(zhuǎn)式均 質(zhì)器8000 rpm ~10000 rpm均質(zhì)1 min ~2 min)；若樣品是液態(tài)，不需要均質(zhì)，震蕩混勻即可。如使用均 質(zhì)袋，可直接進(jìn)行培養(yǎng)；如使用均質(zhì)杯或其他容器，無(wú)菌操作將樣品轉(zhuǎn)移到其他培養(yǎng)容器。
 

　　結(jié)果判定；
 

　　質(zhì)控系統(tǒng)：空白對(duì)照和陰性對(duì)照均未出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線或Ct值≥40，陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲 線并且Ct值<30，且上述對(duì)照HEX通道出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線并且Ct值<40，則檢測(cè)系統(tǒng)正常。否則，任 一種對(duì)照出現(xiàn)非上述正常結(jié)果，應(yīng)重做實(shí)驗(yàn)，同時(shí)排除污染。
 

　　檢測(cè)系統(tǒng)正常的情況下，檢測(cè)樣品Ct值≤35時(shí)，判定PCR結(jié)果為陽(yáng)性；當(dāng)35<檢測(cè)樣品Ct值<40時(shí)， 重復(fù)檢測(cè)一次，如果Ct值<40并且曲線有明顯的對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期，判定PCR結(jié)果為陽(yáng)性，否則判定PCR結(jié)果 為陰性；當(dāng)Ct值≥40或無(wú)Ct值時(shí)，判定PCR結(jié)果為陰性。
 

　　如果PCR結(jié)果為陰性，且HEX通道擴(kuò)增曲線正常，則直接報(bào)告陰性結(jié)果；如果PCR結(jié)果為陰性，且 HEX通道擴(kuò)增曲線Ct值≥40，則直接報(bào)告本次檢測(cè)無(wú)效；如果PCR結(jié)果為陽(yáng)性，則需要根據(jù)7.4進(jìn)行確證實(shí)驗(yàn)。
 

　　結(jié)果與報(bào)告：
 

　　根據(jù)PCR檢測(cè)結(jié)果及確證實(shí)驗(yàn)結(jié)果，報(bào)告25g(mL)樣品中檢出或未檢出金黃色葡萄球菌。