【儀表網 研發快訊】近日，大連化學物理研究所生物技術研究部分子探針與熒光成像研究組(1818組)徐兆超研究員、喬慶龍副研究員團隊發展了一種“靶控自閃爍”熒光探針，并將其命名為“Blinkogenic Probe”，這類探針只有在識別靶標后才會激活自閃爍熒光開關性能，排除了非靶向單分子定位的干擾，提升了單分子超分辨成像的定位準確性，實現了活細胞內免洗動態單分子超分辨成像。
 

　　單分子定位顯微鏡(SMLM)作為重要超分辨成像技術之一，能夠在單分子分辨率下，可視化生物分子的分布、分子間的相互作用、納米尺度的細胞器結構、單個分子的催化反應等。其突破納米成像極限的核心在于熒光開關分子在熒光“亮”態(ON)和“暗”態(OFF)之間轉換的能力，以保證單個分子的熒光信號在不同時間點被區分，并進行精確定位。傳統的發光調控策略，例如紫外光激活、高濃度外源性親核試劑或氧化還原調節劑、探針與靶點結合解離等，雖能獲取稀疏的熒光閃爍信號，卻因生物兼容性問題難以在活細胞內實現原位、動態的超分辨成像，同時，由于缺乏準確的靶點識別能力，SMLM成像技術受到單分子定位時的錯誤信號干擾。
 

　　1818組在前期工作中基于自閃爍熒光探針建立了羅丹明開關分子吉布斯自由能的差值(ΔGC-O)與開環比例的線性關系(R2=0.965)，設計了特定開環比例的羅丹明開關分子，以此高效地開發出了多顏色自閃爍熒光探針，并將其用于活細胞內的動態單分子定位超分辨成像(Angew. Chem. Int. Ed，2020)。盡管自閃爍熒光探針在超分辨成像中展現出重要應用潛力，其仍面臨著成像背景高等挑戰。例如，由于細胞內存在未反應或非特異性結合的自閃爍探針，這些探針同樣會表現出自發閃爍特性，會產生強烈的背景信號并嚴重干擾目標分子的定位，降低了成像的定位準確度。而隨著分辨率的不斷提高，尤其是當接近1nm時，背景信號的問題將變得更加突出，成為制約超分辨成像技術進一步發展的關鍵因素。
 

　　本工作中，團隊發展的Blinkogenic Probe，可在與靶標結合前保持“沉默”狀態，即不產生閃爍；而一旦與靶標結合，其自閃爍性能立即被激活，從而實現精確的單分子定位，有效避免了非特異性標記產生的閃爍背景。為了量化這一特性，團隊引入了新的參數“RDC”，定義為自閃爍激活前后的占空比比值，其中占空比為熒光探針在一定時間內的熒光“亮”態占比。當RDC值大于1時，表明熒光探針在識別靶標后發生了自閃爍激活現象。本工作報道的HM-DS655-Halo的pKcycl為4.5以下，在生理條件下(pH=7.4)能夠保持自閃爍“沉默”狀態，而與HaloTag結合后，其兩性離子結構被進一步穩定，從而激活了自發閃爍。該探針的RDC值達到12，證明了識別HaloTag蛋白能夠高效激活探針的自閃爍性能，并在SMLM成像中有效消除了閃爍背景的干擾。利用這一探針，團隊實現了細胞內動態的SMLM成像，包括線粒體分裂和接觸、細胞遷移和偽足生長等過程。此外，團隊利用該探針能夠精確追蹤活細胞中的各種偽足結構，如絲狀偽足、片狀偽足和隧道納米管(TNT)，并揭示了絲狀偽足和片狀偽足之間的兩種不同融合模式，以及TNT的形成及其與絲狀偽足的相互作用。這些發現充分證明了Blinkogenic Probe自閃爍超分辨熒光探針在納米尺度上可視化實時偽足動態的實用性。
 

 

　　相關研究成果分別以“Spontaneously Blinkogenic Probe for Wash-Free Single-Molecule Localization-Based Super-Resolution Imaging in Living Cells”和“Super-resolution imaging of cellular pseudopodia dynamics with a target-specific blinkogenic probe”為題，于近日發表在《德國應用化學》(Angewandte Chemie International Edition)和《中國化學快報》(Chinese Chemical Letters)上。該工作的共同第一作者為1818組碩士研究生宋澳旋和喬慶龍副研究員，以上研究工作得到國家自然科學基金、我所創新基金等項目的資助。(文/圖/喬慶龍)