【儀表網(wǎng) 研發(fā)快訊】中國(guó)科學(xué)院上海微系統(tǒng)與信息技術(shù)研究所傳感技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室李昕欣/徐鐵剛團(tuán)隊(duì)在高精度數(shù)字PCR系統(tǒng)研制方面取得重要進(jìn)展，研制出依賴液相高壓環(huán)境使用PDMS薄膜芯片實(shí)現(xiàn)高性能數(shù)字PCR系統(tǒng)。相關(guān)成果以“Overcoming bubble formation in polydimethylsiloxane-made PCR chips: mechanism and elimination with high-pressure liquid seal”為題發(fā)表在學(xué)術(shù)期刊《Microsystems & Nanoengineering》上(https://www.nature.com/articles/s41378-024-00725-1)。
 

　　該文章被雜志社評(píng)選為Featured文章，并在國(guó)際學(xué)術(shù)宣傳平臺(tái)“Newswise”以“New PCR chip design: high-pressure liquid seal solves bubble problem”為題進(jìn)行了高度評(píng)價(jià)。新聞評(píng)論說(shuō)：“這一突破的意義遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了實(shí)驗(yàn)室的范疇，這項(xiàng)創(chuàng)新能推動(dòng)具有成本效益的一次性 PCR 芯片的開(kāi)發(fā)，在臨床醫(yī)療領(lǐng)域可依靠有限資源獲得最先進(jìn)的診斷結(jié)果。技術(shù)簡(jiǎn)單高效，有望加速微流控 PCR 技術(shù)與臨床實(shí)踐和研究的結(jié)合，推進(jìn)精準(zhǔn)醫(yī)療的發(fā)展。”(https://www.newswise.com/articles/new-pcr-chip-design-high-pressure-liquid-seal-solves-bubble-problem)。
 

　　數(shù)字PCR是近年來(lái)迅速崛起的單分子水平的精準(zhǔn)基因定量分析技術(shù)。數(shù)字PCR通過(guò)微流控芯片技術(shù)同步進(jìn)行數(shù)萬(wàn)個(gè)等體積的、獨(dú)立的PCR反應(yīng)，然后統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性反應(yīng)比例，根據(jù)泊松分布原理計(jì)算被測(cè)樣品中目標(biāo)分子的絕對(duì)數(shù)量。該技術(shù)判定不需要標(biāo)準(zhǔn)曲線，比目前廣泛應(yīng)用的定量PCR產(chǎn)品更加精準(zhǔn)可靠，是定量PCR技術(shù)理想的迭代更新產(chǎn)品。現(xiàn)有的商業(yè)化數(shù)字PCR系統(tǒng)容易出現(xiàn)由氣泡造成的體積誤差，而且需要密封殼和微閥等復(fù)雜結(jié)構(gòu)來(lái)防止PCR溶液蒸發(fā)及氣泡擴(kuò)大，導(dǎo)致反應(yīng)速度慢、成本高、操作復(fù)雜，致使應(yīng)用仍主要局限于科研領(lǐng)域。
 

　　研究團(tuán)隊(duì)闡明了PDMS芯片在PCR過(guò)程中產(chǎn)生氣泡的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)高溫時(shí)水的飽和蒸氣壓過(guò)高才是引起芯片在PCR反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生氣泡的主要原因，會(huì)導(dǎo)致氣泡體積劇增6.4倍，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)早期研究者曾經(jīng)關(guān)注的0.2倍體積的熱膨脹。氣泡擴(kuò)增會(huì)把PCR溶液擠出反應(yīng)單元，不但毀掉自身反應(yīng)單元還會(huì)給其它反應(yīng)單元造成交叉污染。PDMS芯片在熱循環(huán)時(shí)伴隨著水的氣化-液化循環(huán)，導(dǎo)致高溫時(shí)水蒸氣從反應(yīng)溶液體系中不斷釋放到芯片PDMS材料的納米孔體系中，進(jìn)一步蒸發(fā)到外部空氣中。低溫時(shí)芯片外部的冷空氣通過(guò)納米孔介導(dǎo)被不斷吸入到芯片材料內(nèi)，并進(jìn)入反應(yīng)腔室。二者共同作用形成水蒸氣增強(qiáng)的“呼吸”現(xiàn)象，加速了PCR溶液的蒸發(fā)，導(dǎo)致PCR失敗。
 

　　水蒸氣對(duì) PCR 過(guò)程中氣泡形成的影響(溫度：25-95 °C，壓力：101.325 kPa)。(a)水的飽和蒸汽壓曲線。(b)熱膨脹僅導(dǎo)致氣體體積略有增加(黑線)，而水蒸氣的平衡效應(yīng)導(dǎo)致等溫膨脹體積大幅度增大(紅線)。(c)PCR 過(guò)程中脫氣PDMS 產(chǎn)生的氣泡體積計(jì)算值。(d)從水中溶解的空氣溢出后形成的飽和水蒸氣體積。(e)氣泡形成的可能機(jī)制，涉及熱膨脹 、PDMS 和 PCR 溶液中空氣的溢出和水蒸氣平衡。

 

　　團(tuán)隊(duì)?wèi)?yīng)用此理論開(kāi)發(fā)出基于液相高壓反應(yīng)平臺(tái)的無(wú)閥非密封PDMS薄膜數(shù)字PCR系統(tǒng)：高溫時(shí)，PDMS芯片納米孔內(nèi)部氣體受熱后壓強(qiáng)升高，但是無(wú)法突破外部水環(huán)境的高壓；低溫時(shí)，水環(huán)境阻止了外部氣體倒吸入PDMS芯片，杜絕氣泡的形成。該系統(tǒng)中，儀器實(shí)現(xiàn)高壓液相環(huán)境以阻止氣泡產(chǎn)生和PCR溶液水損失；一次性PDMS芯片實(shí)現(xiàn)PCR芯片的樣品填充和數(shù)字化分離。由于不需要密封殼，簡(jiǎn)化了PDMS芯片制造工藝，使芯片成本大幅下降；由于即不需要開(kāi)關(guān)閥門也不需要密封芯片的樣品進(jìn)出口，簡(jiǎn)化了芯片操作，在保持高準(zhǔn)確度的前提下提高了檢測(cè)速度，實(shí)現(xiàn)高效PCR擴(kuò)增。與市場(chǎng)上現(xiàn)有的數(shù)字PCR系統(tǒng)相比，該系統(tǒng)優(yōu)勢(shì)顯著，具備良好的產(chǎn)業(yè)化前景，有望應(yīng)用于安全防護(hù)、疾控中心、重癥監(jiān)護(hù)室、門急診、海關(guān)、生物制藥等多個(gè)領(lǐng)域。
 

　　左上：結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的裸露PDMS芯片及其數(shù)字化結(jié)果；左下：常壓氣相環(huán)境下芯片由于氣泡以及蒸發(fā)導(dǎo)致反應(yīng)失敗；右邊：高壓液相反應(yīng)示意以及PCR反應(yīng)結(jié)果。