CarboMAX 是一種創新的專禾刂偶聯技術，專為高溫下的肽鏈合成而設計。該技術相較于現行的碳二亞胺方法，提供了更快的反應激活速度，和減少相應的外消旋化，從而顯著提升了合成效率。此外，CarboMAX 在高溫條件下增強了對酸敏感連接物的穩定性，特別對于磷酸肽、糖肽的合成，以及在超酸敏感鏈接劑上進行肽鏈合成時，這一特性尤其有利。
02 引言 Introduction
近期研究表明，在 90°C 的條件下，利用高效固相肽合成過程（HE-SPPS）進行的原位碳二亞胺激活可以實現快速且高效的肽偶聯。HE-SPPS 避免了使用基于季銨鹽的方法（例如 HCTU 和 HATU）時所需的大量強堿，從而減少了顯著的外消旋化問題（特別是對于半胱氨酉夋），以及由于d-內酰胺形成而導致的精氨酉夋缺失。CarboMAX 偶聯方法通過對現有碳二亞胺方法的兩個主要改進，進一步提升了合成效果：
(i) 提升粗制品純度與減少外消旋化：
CarboMAX 通過提高相對于氨基酸的碳二亞胺用量（2當量），加速了必要的O-酰基異脲激活中間體的形成，這一過程在碳二亞胺激活中通常較為緩慢。O-酰基異脲形成的速率增加，使得偶聯步驟早期即可獲得更多的激活氨基酸。因此，實現了更快的偶聯速度，并相應地降低了外消旋化的發生。在眾多實例中，CarboMAX 的應用顯著提升了粗制品的純度。
(ii) 避免酸敏感官能團/接頭的非期望裂解：
與碳二亞胺化學反應配合使用的激活劑（如Oxyma Pure）具有酸性，可能在高溫下過早地移除酸敏感基團。CarboMAX 方法通過使用少量的堿（相對于激活氨基酸 0.4 當量的 DIEA）來穩定這些酸敏感連接體。這些堿的用量足夠低，不會干擾激活過程，同時保持外消旋化降至蕞低。
03 材料與方法 Materials and Methods
試劑
所有標準的 Fmoc 氨基酸均購自 CEM 公司（位于北卡羅來納州的馬修斯），包含以下側鏈保護基團：Arg(Pbf)，Asn(Trt)，Asp(OMpe)，Cys(Trt)，Gln(Trt)，Glu(OtBu)，His(Trt)，Lys(Boc)，Ser(tBu)，Thr(tBu)，Trp(Boc)和Tyr(tBu)。磷酸化氨基酸 Fmoc-Ser(PO(OBzl)OH)-OH和Fmoc-Thr(PO(OBzl)OH)-OH，Oxyma Pure 以及 Rink Amide ProTideTM LL 樹脂也購自 CEM 公司（位于北卡羅來納州的馬修斯）。Fmoc-Thr(β-D-GlcNAc(Ac)3)-OH和Fmoc-Lys(palmitoyl-Glu-OtBu)-OH 購自 Bachem（瑞士）。N,N-二異丙基碳二亞胺（DIC），N,N-二異丙基乙胺（DIEA），哌啶，三氟乙酉夋（TFA），3,6-二氧雜-1,8-辛二硫醇（DODT），三異丙基硅烷（TIS）和乙酸購自 Sigma-Aldrich（密蘇里州圣路易斯）。二氯甲烷（DCM），N,N-二甲基甲酰胺（DMF）和無水乙酉迷（Et2O）購自VWR（賓夕法尼亞州西切斯特）。HPLC級水（H2O）和HPLC級乙腈（MeCN）購自Fisher Scientific（馬薩諸塞州沃爾瑟姆）。
肽合成
肽的制備采用 0.05 或 0.1 毫摩爾規模，使用 CEM Liberty Blue™ 自動化微波肽合成儀，在 0.18 毫摩爾/克的 Rink Amide ProTide LL 樹脂（CEM零件號R002）上進行，除非另有說明。去保護反應使用含有20% 哌啶的 DMF 進行。偶聯反應使用 5 當量的氨基酸，以 Fmoc-AA-OH/DIC/Oxyma Pure 在 DMF 中進行。切割步驟使用 CEM Razor 高通量肽切割系統，在升高的溫度下用 TFA/H2O/TIS/DODT 進行 30 分鐘。切割后，肽在冷乙酉迷中沉淀并過夜凍干。
肽分析
肽的分析在配備有 PDA 檢測器的 Waters Acquity UPLC 系統上進行，該系統裝配了 Acquity UPLC BEH C8 柱（1.7 mm 和 2.1 x 100 mm）。UPLC 系統連接到 Waters 3100 Single Quad MS 以進行結構鑒定。峰分析通過 Waters MassLynx 軟件實現。分離采用含有0.05% TFA 的 (i) H2O 和 (ii) MeCN 的梯度洗脫進行。
04 結果 Results
通過采用 CarboMAX 策略（即相對于氨基酸使用 2 當量的 DIC），相較于傳統的 1 當量使用，顯著提升了肽的純度。
這一改進在 8 種矢口名肽的合成過程中得到了驗證，這些肽分別采用了標準碳二亞胺化學方法和 CarboMAX 策略進行合成（見表1；圖1至6）。關鍵的是，在使用過量碳二亞胺的過程中，并未發現不良封端現象。
表1. 通過應用 CarboMAX 偶聯方法改善了肽的純度
肽 | 粗純度 （標準） | 粗純度 （CarboMAX） |
Thymosin | 63% | 75% |
GRP | 62% | 74% |
Bivalirudin | 80% | 82% |
1-34PTH | 67% | 85% |
35-55MOG | 77% | 91% |
Magainin 1 | 71% | 79% |
Dynorphin A | 74% | 82% |
Liraglutide* | 74% | 88% |
*用~0.32 mmol/g Fmoc-Gly-Wang PS樹脂合成
通過優化O-酰基異脲的形成過程，CarboMAX 技術能夠迅速供應更高濃度的活性氨基酸。這一優勢對于縮短敏感酯類物質在后續酰化反應前的存活時間至關重要。為了證實此效果，研究人員采用了水解、繼之衍生化以及氣相色譜（由 C.A.T. GmbH 執行）等手段，對 Liraglutide 序列中各氨基酸的差向異構水平進行了深入分析。表 2 的數據明顯顯示，在使用 CarboMAX 的過程中觀察到的差向異構現象有減少的趨勢，從而佐證了加速O-酰基異脲生成的理論。因此，相較于以往描述的任何高溫偶聯方法，CarboMAX 偶聯技術憑借其提升的偶聯效率和降低的差向異構率，實現了更佳的粗制品純度。
表2. 利拉魯月太的差向異構化水平
%-D 差向異構體 | 2 分鐘 90 °C 標準 | 2 min-90 °C CarboMAX |
D-Ala | 0.33 | 0.25 |
D-Arg | 0.29 | 0.20 |
D-Asp | 0.23 | 0.31 |
D-Glu | 0.39 | 0.30 |
D-Ile L-allo Ile D-allo Ile | <0.10 <0.10 <0.10 | <0.10 <0.10 <0.10 |
D-Leu | 0.17 | 0.13 |
D-Lys | <0.10 | 0.10 |
D-Phe | 0.20 | 0.16 |
D-Ser | 0.16 | 0.12 |
D-Thr L-allo Thr D-allo Thr | <0.10 <0.10 <0.10 | <0.10 <0.10 <0.10 |
D-Trp | 0.24 | <0.10 |
D-Tyr | 0.12 | 0.11 |
D-Tyr | <0.10 | <0.10 |
CarboMAX 策略的一個可選優化是在氨基酸反應中采用 0.4 當量的堿。這一調整確保了在整個激活和偶聯過程中，DIEA（N,N-二異丙基乙胺）以催化量存在，有效地穩固了酸敏感鍵合（詳見表 3）。該優化最初通過應用超酸敏感樹脂鏈接劑進行了驗證。在肽合成領域，運用諸如2-Cl-三苯甲基、三苯甲基（Trt）以及 Cl-TCP 這類超酸敏感鏈接劑至關重要，它們促進了受保護的肽段的縮合，防止了二酮哌口秦生成，規避了在樹脂裝載時的DMAP使用，并顯著減少了 C 端半胱氨酉夋殘基發生β消去的風險。
在 90°C 條件下，采用 DIC/Oxyma Pure 進行的標準碳二亞胺偶聯反應僅進行了 2 分鐘，這導致了在三苯甲基樹脂連接劑上合成 ACP 肽的產率不盡人意。不過，當反應中加入了 0.1 當量的 DIEA 并在同樣的高溫下實施 CarboMAX 偶聯策略時，不僅保護了三苯甲基連接劑的鍵穩定性，還成功地將產率顯著提升，從原先的 38% 躍升至 96%。這一顯著的提升彰顯了 CarboMAX 偶聯方法在提高肽合成效率方面的*性。
表3. 使用高酸敏感型 Fmoc-Gly-NovaSyn TGT 樹脂合成ACP
偶聯溫度（°C） | 偶聯時間（min） | 激活 | DIEA（當量） | 粗品純度（%） | 粗品收率（%） |
90 | 2 | DIC/Oxyma Pure | 0 | 90 | 38 |
90 | 2 | DIC/Oxyma Pure | 0.1 | 95 | 38 |
65-74ACP: VQAAIDYING
在高溫條件下，涉及磷酸氨基酸衍生物的合成反應面臨著由β-消除引起的磷酰基團丟失的風險，這種風險在去保護和酸性切割過程中尤為顯著。此外，一旦磷酸氨基酸被引入到序列中，它所產生的顯著空間位阻會使得后續殘基的偶聯變得異常困難。采用 CarboMAX 偶聯方法并配合 0.4 當量的 DIEA，研究成功合成了以 3 個磷酸氨基酸殘基為主的目標磷酸肽，如圖 7a 所展示的成果。與此形成鮮明對比的是，未添加 DIEA 的合成實驗未能檢測到目標肽的存在（圖 7b）。
TpTGNGKPVECpSQPESSFKMpSFKR
圖7a. 使用 UPLC-MS 分析粗磷酸肽 0.4 等效 DIEA （CarboMAX）
圖7b. 粗磷酸肽的 UPLC-MS 分析（標準品）
此外，O-連接的糖基氨基酸含有可能在高溫碳二亞胺偶聯過程中斷裂的敏感鍵。通過采用 CarboMAX 偶聯技術并添加 0.4 當量的 DIEA，實現了 MUC-1 糖肽的合成，粗品純度高達 72%，如圖 8 所示。值得一提的是，CarboMAX 方法僅需要使用 2 當量的糖基氨基酸過量，這在考慮到糖基化氨基酸昂貴成本的情況下，顯著降低了材料費用，經濟效益顯著。
PAHGVT[β-D-GlcNAc(Ac)3]SAPDTRPAPGSTAP
圖8. 使用 UPLC-MS 分析粗 MUC-1 糖肽 0.4 等效 DIEA （CarboMAX）
05 結論 Conclusion
CarboMAX 方法通過微波輔助的固相肽合成技術實現了更快的偶聯反應和較低的差向異構化。對于昂貴或難以合成的氨基酸殘基，僅需使用 2 當量即可有效進行偶聯。此外，可選地加入催化量的 DIEA（0.4 當量），有助于在高溫條件下預防酸敏感鍵的不必要斷裂，從而保護了肽鏈的完整性。
引用 References
(1) J. Collins, K. Porter, S. Singh and G. Vanier, “High-Efficiency Solid Phase Peptide Synthesis (HE-SPPS)," Org. Lett., vol. 16, pp. 940-943, 2014.
(2) Patent Pending: US15686719; EP17188963.7
(3) Patent Pending: US20160176918; EP3037430;JP2016138090; CN105713066; AU2017204172
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