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酶聯免疫吸附技術(ELISA)的操作要點

時間:2015/4/23閱讀:197
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    的試劑,良好的儀器和正確的操作是保證elisa 檢測結果準確可靠的必要條件。ELISA 的操作因固相載體的形成不同而有所差異,國內醫學檢驗一般均用板式點。本文將敘述板式ELISA 各個操作步驟的注意要點,珠式、管式及磁性球ELSIA ,國外試劑均與特殊儀器配合應用,兩者均有詳細的使用說明,嚴格遵照規定操作,必能得出準確的結果。

1 標本的采取和保存

    可用作 ELISA 測定的標本十分廣泛,體液(血清)、分泌物(唾液)和排泄物(如尿液、糞便)等均可作標本以測定其中某種抗體或抗原成份。有些標本可直接進行測定(如血清、尿液),有些則需經預處理(如糞便和某些分泌物)。大部分ELISA 檢測均以血清為標本。血漿中除尚含有纖維蛋白原和抗凝劑外,其他成份均同等于血清。制備血漿標本需借助于抗凝劑,而血清標本只要待血清自然凝固、血塊收縮后即可取得。除特殊情況外,在醫學檢驗中均以血清作為檢測標本。在ELISA 中血漿和血清可同等應用。

    血清標本可按常規方法采集,應注意避免溶血,紅細胞溶解時會釋放出具有過氧化物活性的物質,以HRP 為標記的ELISA 測定中,溶血標本可能會增加非特異性顯色。

2 試劑的準備

    按ELISA試劑盒說明書的要求準備實驗中需用的試劑。 ELISA 中用的蒸餾水或去離子水,包括用于洗滌的,應為新鮮的和高質量的。自配的緩沖液應用pH 計測量較正。從冰箱中取出的試驗用試劑應待溫度與室溫平衡后使用。試劑盒中本次試驗不需用的部分應及時放回冰箱保存。

3 加樣

    在 ELISA 中一般有3 次加樣步聚,即加標本,加酶結合物,加底物。加樣時應將所加物加在LEISA 板孔的底部,避免加在孔壁上部,并注意不可濺出,不可產生氣泡。

    加標本一般用微量加樣器,按規定的量加入板孔中。每次加標本應更換吸嘴,以免發生交叉污染,也可用一次性的定量塑料管加樣。有此測定(如間接法 ELISA )需用稀釋的血清,可在試管中按規定的稀釋度稀釋后再加樣。也可在板孔中加入稀釋液,再在其中加入血清標本,然后在微型震蕩器上震蕩1 分鐘以保證混和。加酶結合物應用液和底物應用液時可用定量多道加液器,使加液過程迅速完成。

4 保溫

    在 ELISA 中一般有兩次抗原抗體反應,即加標本和加酶結合物后。抗原抗體反應的完成需要有一定的溫度和時間,這一保溫過程稱為溫育(incubation) ,有人稱之為孵育,在ELISA 中似不恰當。

    ELISA 屬固相免疫測定,抗原、抗體的結合只在固相表面上發生。以抗體包被的夾心法為例,加入板孔中的標本,其中的抗原并不是都有均等的和固相抗結合的機會,只有zui貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸。這是一個逐步平衡的過程,因此需經擴散才能達到反應的終點。在其后加入的酶標記抗體與固相抗原的結合也同樣如此。這就是為什么ELISA 反應總是需要一定時間的溫育。溫育常采用的溫度有 4337、室溫和4(冰箱溫度)等。37是實驗室中常用的保溫溫度,也是大多數抗原抗體結合的合適溫度。在建立ELI SA 方法作反應動力學研究時,實驗表明,兩次抗原抗體反應一般在371-2 小時,產物的生成可達。為加速反應,可提高反應的溫度,有些試驗在43進行,但不宜采用更高的溫度。抗原抗體反應4更為*,在放射免疫測定中多使反應在冰箱中過夜,以形成zui多的沉淀。但因所需時間太長,在ELISA 中一般不予采用。



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