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科研實驗中血標本提取RNA的方法

時間:2015/4/30閱讀:1024
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    在用血液標本進行基因表達研究時,需要及時把新鮮血液中有核細胞的RNA提取出來。全血還不能直接放到-80℃保存,即使在-80℃保存,全血中的RNA也容易發(fā)生降解。傳統(tǒng)的提取新鮮全血RNA方法是把先把有核細胞從全血中分離出來,需要加白細胞分離液、離心等步驟,比較繁瑣,在臨床醫(yī)院往往難以實施,的RNA提取方法為RN01 TRIpure LS裂解全血提取RNA

()淋巴細胞分離液分離單個核細胞:
    外周血及骨髓(抗凝)利用淋巴細胞分離液分離單個核細胞
1)外周血送檢需5-10ml抗凝血,骨髓需1-3ml抗凝,常溫送檢(樣本量根據單個核細胞的數量來確定,一般需要5x106單個核細胞以上)
2)加入等體積無菌PBS于外周血及骨髓中充分混合,形成細胞懸液;
3)加入5ml淋巴細胞分離液于另一離心管。
4)吸取5ml細胞懸液沿管壁輕輕加入到淋巴細胞分離液表面(注意勿與淋巴細胞分離液混合)。離心1500rpm 20min
5)用吸管輕輕吸出界面層(白膜)中的MNC入另一離心管中。無菌冷PBS2次,zui后1次洗滌可以將細胞懸液移入EP管中,離心去上清直接或加入TRIzol混勻后-70℃凍存,或直接提取RNA(可以*行細胞計數以保證細胞數)。

()紅細胞裂解液分離單個核細胞:
1)血液收集:用肝素抗凝,因為EDTA可能會對后續(xù)的pcr有影響,因為EDTA會螯合pcr反應中的Mg2+,也可以根據實驗的具體要求看選擇怎么樣的抗凝。
2)白細胞的分離:一般選擇1.5ML新鮮的血液,或選取冷凍的5ML的血液(冷凍血液的保存:先液氮速凍,再置于-80°保存),或隔天的5ML的血液,就可以分離到比較多的白細胞了。可以選擇溶紅素或紅細胞裂解液按一定的比例(1315)分離白細胞,一般在3500轉離心6分鐘即可,效果不好的話,可以重新裂解一次。
3)分離得到的白細胞,立刻用質量好的TRIZOL裂解白細胞,如果不能馬上提取的話,可以置于-20-80保存,過后抽提(選擇一般的組織或細胞的RNA抽提ELISA試劑盒即可)。

() RN01 TRIpure LS裂解全血提取RNA
    液體樣本RNA提取試劑RN01 TRIpure LS。可以直接裂解全血提取RNA,避免了先裂解白細胞可能導致的RNA降解,也大大簡化了操作步驟。操作時間比普通方法節(jié)約至少三分之一。

1)在臨床上采血時,可以先把TRI pure LS Reagent分裝750ul1.5ml的離心管中。
2)血液樣本可以先抗凝處理(EDTA抗凝或者其他抗凝方式都可),然后取250ul全血樣品加入到750ulTRI pure LS Reagent中,用移液槍反復抽打并振蕩混勻,在室溫裂解5min-10min,直至血細胞充分發(fā)生裂解。
3)此裂解液保存在-20℃下可達2個月,-80℃可達半年,4℃可以1天。
4)樣品在15 -30°C條件下孵育5分鐘以使核蛋白體*分解。
5)每1ml TRIpure0.2ml氯仿,蓋緊樣品管蓋,用手用力搖晃試管15秒并將其在室溫下孵育2~3分鐘。在2~8°C下以不超過12,000×g的離心力高速冷凍離心15分鐘。離心后混合物分成三層:下層*-氯仿層,中間層,上層無色的水樣層。RNA在于水樣層,水樣層的容量大約為所加TRIpure 容量的60%
6)將水樣層轉移到新EP管中(如果希望分離DNA和蛋白,有機層同樣要予以保留),zui初均化時的每1ml TRIpure 對應0.5ml異丙醇,將混合的樣品在-15 -30°C條件下孵育10分鐘;
7)在2~8°C下以不超過12,000×g的離心力高速冷凍離心10分鐘(RNA沉淀在離心前通常不可見,形成一膠狀片狀沉淀附著于試管壁和管底;
8)移去上層懸液。用75%的乙醇洗滌RNA沉淀一次(每1mlTRIpure 至少加1ml75%乙醇),在2~8°C下以不超過7,500×g的離心力高速冷凍離心5分鐘;
9)簡單干燥RNA沉淀(空氣干燥或真空干燥5~10分鐘,不能讓RNA沉淀*干燥那樣會極大地降低它的可溶性)。部分溶解的RNA樣品其A260/280比值<1.6。用移液管尖分幾次移取無RNA酶的水或0.5%SDS溶液來溶解RNARNA還能被甲酰胺(除去離子)再溶解并保存在–70°C



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