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人包皮成纖維細胞,HFF

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更新時間:2018-01-21 09:28:00瀏覽次數:358次

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產品名稱:人包皮成纖維細胞,HFF

細胞術檢測樣品制備方法

A. 直接標記抗體(FITC標記抗體)

(1) 收集1×106個細胞,800rpm離心5min,4以上冷PBS洗一次。

(2) 4%多聚甲醛1ml室溫固定40分鐘,800rpm離心5min去上清。加2ml PBS重懸洗滌細胞,800rpm離心5min。

(3) 1ml5% 人血清的 PBS 重懸細胞,冰上孵育10min800rpm離心5min去上清。加入200ul0.5%BSA 和飽和劑量的熒光標記抗體(5×105個細胞/20ul抗體)PBS ,避光冰上放置30min,離心棄上清。加入200ul 1% 多聚甲醛固定,待測即可。

(4) 用流式細胞儀檢測熒光值,每管計數10 000個細胞。[2]

B. 未標記抗體間接免疫熒光標記法:

(1)收集2×106個細胞,用冷的PBS 2ml 洗滌細胞一次,800rpm離心5min。

(2)2ml 4%多聚甲醛室溫固定細胞40min,800rpm離心5min2ml PBS重懸細胞,800rpm離心5min

(3)1ml0.2%Triton-X1005%血清的PBS重懸細胞,冰上放置10min,800rpm離心5min

(4)加入飽和劑量未標記抗體,冰上放置40min,800rpm離心5min,用2ml冷的PBS 重懸細胞,800rpm離心5min,洗去未結合一抗,重復一次。

(5)加入熒光標記(FITC)標記的二抗,冰上避光放置40min后,800rpm離心5min,去上清,PBS洗滌兩次。

(6)加入0.5ml 1%多聚甲醛重懸細胞;固定待測。

(7)流式細胞儀檢測熒光值,每管計數10 000個細胞。

C.細胞周期、細胞凋亡及DNA倍體分析樣品(PI染色)的制備:

(1)待測樣本制成單細胞懸液,然后200g離心5分鐘,棄上清。

(2)4預冷的70%冷乙醇固定,4保存 ,至少固定18小時。

(3)調整細胞濃度為106細胞/毫升,取1毫升細胞懸液,用PBS洗三次,細胞重懸于1毫升PI染液中,37孵育30分鐘即可進行流式分析。

(4)PI染液終濃度為50微克/毫升,RNase A終濃度為20微克/毫升。

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