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氨基轉移反應的定性鑒定

時間:2018/4/25閱讀:214
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一、實驗目的
(1)學習一種鑒定氨基轉移作用的簡便方法及其原理;
(2)進一步掌握紙層析的原理和操作技術;
(3)了解氨基轉移作用在中間代謝中的意義。
二、實驗原理  
氨基移換酶也稱轉氨酶,它能催化α-氨基酸的氨基與α-酮酸的α-酮基互換,這種作用稱為氨基移換作用。它在生物體內蛋白質的合成與分解等中間代謝中,在糖、脂肪、蛋白質三類物質代謝的相互、相互轉化上,都起著很重要的作用。任何一種氨基酸進行轉氨作用時,都由其專一的轉氨酶催化。它們的zui適pH接近7.4。在各種轉氨酶中,以*—草酰乙酸轉氨酶(簡稱谷草轉氨酶、GOT)及*—丙酮酸轉氨酶(簡稱谷丙轉氨酶、GPT)活力zui強。
三、試劑與器材 
解剖器具、離心機、恒溫水浴、干燥箱、臺秤、層析系統等。
1/15mol/L磷酸緩沖液(pH=7.4)、1%*溶液(用KOH中和至中性)、1%丙酮酸溶液(用KOH中和至中性)、0.1%碳酸氫鉀溶液、0.05%碘乙酸溶液、15%三氯醋酸溶液、標準*溶液(0.1%)、標準*溶液(0.1%)、0.1%水合茚三酮乙醇溶液、酚溶劑。
四、操作方法 
將兔擊暈,迅速解剖,取出肝臟,在低溫條件下剪碎。稱取勻漿后,離心取上清液,即為制備的酶液。體外氨基移換反應。紙上層析法檢查每人4個點(標準*溶液、標準*溶液、對照上清液、樣品上清液)。點樣放入層析罩內。用被酚所飽和的水溶液,平衡后,用帶小漏斗的玻璃管從層析罩上加飽合酚試劑25ml于層析缸內。然后,立即蓋緊塞子,當溶劑前沿達到距濾紙上端約2.5cm處,取出濾紙,晾干或吹干,以除去酚溶劑,噴灑0.1%茚三酮乙醇溶液,放入烘箱中顯色氨基酸與茚三酮反應,在濾紙上呈現紫紅色斑點。
五、關鍵步驟與注意事項
① 取動物新鮮組織制備酶液,防止酶失活。
② 加碘乙酸抑制酶解作用。

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