1、變性溫度與時(shí)間

模板變性溫度是決定PCR反應(yīng)中雙鏈DNA解鏈的溫度，達(dá)不到變性溫度就不會(huì)產(chǎn)生單鏈DNA模板，PCR也就不會(huì)啟動(dòng)。變性溫度低則變性不wan全，DNA雙鏈會(huì)很快復(fù)性，因而減少產(chǎn)量。變性溫度太高，又會(huì)影響酶的活性，一般情況下可設(shè)為94℃ 20-30秒，高溫時(shí)間應(yīng)盡量縮短，以保持耐熱DNA聚合酶的活力，最高變性溫度不宜超過95℃。

2、退火溫度與時(shí)間

退火溫度決定PCR特異性與產(chǎn)量。溫度高特異性強(qiáng)，但過高則引物不能與模板牢固結(jié)合，DNA擴(kuò)增效率下降；溫度低產(chǎn)量高，但過低可造成引物與模板錯(cuò)配，非特異性產(chǎn)物增加。合適的退火溫度一般在45-68℃之間。設(shè)置特定反應(yīng)的最適退火溫度，可根據(jù)引物的（G+C）%含量進(jìn)行推測(cè)，一般實(shí)驗(yàn)中退火溫度比擴(kuò)增引物的熔解溫度Tm低5℃，退火時(shí)間一般為30-60秒，足以使引物與模板之間結(jié)合，沒有必要長(zhǎng)時(shí)間退火。

3、延伸溫度與時(shí)間

PCR反應(yīng)的延伸溫度一般選擇在70-75℃之間，延伸時(shí)間根據(jù)所有聚合酶擴(kuò)增速度和擴(kuò)增片段大小設(shè)定。如同樣擴(kuò)增2kb片段，若使用Taq酶只需要1分鐘，使用Pfu酶則應(yīng)設(shè)定2分鐘以上。延伸時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增帶的出現(xiàn)。時(shí)間太短則可能得不到擴(kuò)增產(chǎn)物或得到一些短的非特異性片段。

4、循環(huán)次數(shù)

可根據(jù)模板DNA的量，擴(kuò)增片段的大小和擴(kuò)增產(chǎn)物的下步應(yīng)用等因素，設(shè)定30-40個(gè)循環(huán)。循環(huán)次數(shù)太少，擴(kuò)增量不足，如果循環(huán)次數(shù)太多，錯(cuò)配幾率會(huì)增加，非特異性背景嚴(yán)重。所以，在保證產(chǎn)物得率的前提下，應(yīng)盡量減少循環(huán)次數(shù)。