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生物實驗中細胞融合前準備

時間:2015/8/17閱讀:318
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一、骨髓瘤細胞系的選擇

    骨髓瘤細胞應和免疫動物屬于同一品系,這樣雜交融合率高,也便于接種雜交瘤在同一品系小鼠腹腔內產生大量McAb。用于融合試驗的主要骨髓瘤細胞系有P3/X63-Ag8X63)、P3/X63-Ag8.653X63-Ag8.653)、P3/NSI-1-Ag4-1NS-1)、P3/X63-Ag8.UlP3Ul)、SP2/0-Ag14SP2/0)、F0S194/5.XXO.BU.1MPC11-45.6TG1.7210.RCY3.Ag1.2.3GM15006TG-A12U-266AR等。

    骨髓瘤細胞可用一般的培養液,如RPMI1640DMEM培養基進行培養。小牛血清的濃度一般在10%20%,細胞濃度以1045×105/ml為宜,zui大濃度不得超過106/ml。當細胞處于對數生長的中期時,可按13110的比例傳代。每35天傳代一次。細胞在傳代過程中,部分細胞可能有返祖現象,應定期用8-氮*進行處理,使生存的細胞對HAT呈均一的敏感性。

   在組織培養中,單個或少數分散的細胞不易生長繁殖,若加入其它活細胞,則可促進這些細胞生長繁殖,所加入的這種細胞被稱為飼養細胞。在制備McAb的過程中,許多環節均需要加飼養細胞,如在雜交瘤細胞篩選、克隆化和擴大培養過程中,加入飼養細胞是十分必要的。常用的飼養細胞有:小鼠腹腔巨噬細胞(較為常用)、小鼠脾臟細胞或胸腺細胞。也有人用小鼠成纖維細胞系3T3經放射線照射后作為飼養細胞。飼養細胞的量一般為2×104105細胞/孔。

二、細胞融合的步驟

    細胞融合一般包括制備飼養細胞層、制備免疫脾細胞、制備骨髓瘤細胞及融合等四個步驟。

    制備飼養細胞層時一般選用小鼠腹腔巨噬細胞,與免疫小鼠相同品系的小鼠,常用BALB/C小鼠,610周后拉頸處死;浸泡在75%酒精內,35min后用無菌剪刀剪開皮膚,暴露腹膜,用*注入56ml預冷的培養液(嚴禁刺破腸管),反復沖洗,吸出沖洗液放入10ml離心管,1200rpm分離56min后,用20%小牛血清(NCS)或胎牛血清FCS)的培養液混懸,調整細胞數至1×105/ml,進行培養。

  制備免疫脾細胞時先將zui后一次加強免疫3天后小鼠拉頸處死,無菌取脾臟,培養液洗 一次后,將脾臟研碎,過不銹鋼篩網后離心,細胞用培養液洗2次,計數后取108脾淋巴細胞懸液備用。

  制備骨髓瘤細胞時應取對數生長骨髓瘤細胞離心,用無血清培養液洗2次,計數后取1×107細胞備用

  融合時先將骨髓瘤細胞與脾細胞按11015的比例混合在一起,在50ml離心管中用無血清不*培養液洗1次,離心后棄上清,用吸管吸凈殘留液體,以免影響聚乙二醇(PEG)濃度。輕輕彈擊離心管底,使細胞沉淀略松動。在90s內加入37預溫的1ml 45%PEG(分子量4000)溶液,邊加邊輕微搖動。37水浴作用90s。每隔2min分別加入1ml2ml3ml4ml5ml6ml的不*培養液以終止PEG作用。離心棄上清,用含20%小牛血清HAT選擇培養液重懸。將上述細胞,加到已有飼養細胞層的96孔板內,每孔加100μl。一般一個免疫脾臟可接種496孔板。將培養板置375%CO2培養箱中培養。


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